高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术以pcDNA3.1(‑)质粒为骨架，将cumate‑cymR诱导表达调控单元装入pUC ori高拷贝复制子和Ampicillin抗性基因之间，同时将pET‑28a T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列插入cumate‑cymR调控单元的下游构建出高复制和高表达的重组质粒DN‑001。本发明专利技术的重组质粒DN‑001具有最经济、最方便和高产量等优点，使得基因表达载体的重组省时、省力；可以适用于生产大剂量的重组蛋白；同时有效地抑制了漏出表达，使得这一载体特别适合有毒蛋白的表达，使得这一载体具有广泛的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用
本专利技术属于基因工程
，特别是涉及一种通过基因工程方法改造的高拷贝高表达重组质粒，及该重组质粒在外源基因表达中的应用。
技术介绍
原核生物基因表达系统是最经济、最方便和使用最广泛的重组基因表达系统，包括His标签重组蛋白的表达(现有文献：RosanoGL,CeccarelliEA.RecombinantproteinexpressioninEscherichiacoli:advancesandchallenges.FrontMicrobiol.2014Apr17；5:172；WingfieldPT.Overviewofthepurificationofrecombinantproteins.CurrProtocProteinSci.2015Apr1；80:6.1.1-35有相关说明)。His标签由6个组氨酸组成，分子量小、免疫原性差、不改变蛋白质的空间结构及其溶解性；利用带镍离子的填料进行亲和纯化，方法简单、成本低、目标蛋白纯度高，是目前应用最广泛的融合表达亲和标签。pET和PQE系列质粒载体是目前最常用的His蛋白表达载体，目的基因被克隆到pET和PQE质粒载体上，受T7或T5强转录及翻译(可选择)信号控制；充分诱导时，细菌能高度地表达目的蛋白。然而，pET和PQE系列质粒表达系统存在三个明显的缺陷。其一，它们在大肠杆菌中的复制效率低，基因重组费时、成本高；其二，重组的目的蛋白易漏出表达，表达有毒蛋白时会抑制细菌生长甚至杀灭细菌。其三，诱导剂IPTG的高花费和潜在的毒性阻碍这一表达系统用于生产大剂量的重组蛋白。近年开发的另一原核生物表达系统---cumate诱导表达系统(现有文献：ChoiYJ,MorelL,LeT,BourqueD,BourgetL,GroleauD,MassieB,MíguezCB.Novel,versatile,andtightlyregulatedexpressionsystemforEscherichiacolistrains.ApplEnvironMicrobiol.2010，76(15):5058-66；MullickA,XuY,WarrenR,KoutroumanisM,GuilbaultC,BroussauS,MalenfantF,BourgetL,LamoureuxL,LoR,CaronAW,PilotteA,MassieB.Thecumategene-switch:asystemforregulatedexpressioninmammaliancells.BMCBiotechnol.2006，6:43有关原核生物表达系统---cumate诱导表达系统的说明)被认为优于pET和PQE系列质粒载体系统。这一系统采用结合cuo操纵子的CymR阻遏物进行调控，外源基因的表达依赖诱导剂cumate加入，由于小分子化合物Cumate水溶性好而且无毒，这一系统适用于生产大剂量的重组蛋白。然而，国内市场尚无相关的质粒载体。另外，我们测试发现依文献构建的载体有漏出表达。因此，借鉴cumate诱导系统构建新的高拷贝高表达且无漏出表达的质粒载体将会有极大的市场价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高拷贝高表达重组质粒，利用该重组质粒在外源基因表达中的应用，以及在表达有毒蛋白中的应用。通过这一新的表达载体在大肠杆菌DH5α和TOP10等中高度复制,携带的外源基因在大肠杆菌中呈高水平且严格依赖诱导剂cumate表达,无漏出表达；实现了重组质粒DN-001在大肠杆菌DH5α和TOP10中的高拷贝复制，重组质粒DN-001携带的外源基因实现了在大肠杆菌BL21(DE3)中高表达His标签蛋白，重组质粒DN-001携带的外源基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的无漏出表达，表达有毒蛋白时，细菌可以保持良好的生长状态，解决以上现有技术的不足。为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术为一种高拷贝高表达重组质粒的构建，所述重组质粒由pUCori复制启动子、Ampicillin抗性基因、cymR基因、T5启动子、cym-cmt操纵子、多克隆位点和His标签组成；所述重组质粒的构建包括如下步骤：SS01采用质粒pcDNA3.1(-)为模板，PCR扩增出含pUCori复制启动子和Ampicillin抗性基因的片段pUC-Amp，设计引物为：pcDNA-5:TCGACCTCTAGCTAGAGCTTpcDNA-3:TATATGGGCTATGAACTAASS02基因合成由cymR基因表达盒、T5启动子、cym-cmt操纵子和多克隆位点组成的cumate诱导表达DNA序列cymR-cuo；SS03通过无缝连接将SS01得到的pUC-Amp和SS02得到的cymR-cuo两片段连接环合为原核系统表达载体DN-002；SS04以质粒pET-28a为模板，PCR扩增出含T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列的DNA片段M-His-T，设计引物为：pET-5:CGCCCATGGTAACTTTAAGAAGGAGATpET-3:CGCCTCGAGATCCGGATATAGTTCCTCSS05将步骤SS04中的DNA片段M-His-T和步骤SS03中的质粒DN-002用NcoI和XhoI进行双酶切，试剂盒纯化回收后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取重组质粒DN-001，如SEQIDNO1所示。进一步地，所述高拷贝高表达重组质粒在表达有毒蛋白中的应用。进一步地，所述高拷贝高表达重组质粒在外源基因表达中的应用。本专利技术所依据的原理：以pcDNA3.1(-)质粒为骨架，将cumate-cymR诱导表达调控单元装入pUCori高拷贝复制子和Ampicillin抗性基因之间，同时将pET-28aT7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列插入cumate-cymR调控单元的下游构建出高复制和高表达的重组质粒DN-001。这一新的表达载体有如下四个优点：(1)由于含有pUCori高拷贝复制子，因此它可以高效率启动质粒复制，我们从每ml饱和生长菌中提取超过15μgDN-001质粒，而提取的pET-28a和PQE-60等质粒低于1μg，(2)在T5强启动子的作用下外源基因高度表达，充分诱导时外源基因的表达量超过细菌总蛋白50％以上。使用这一载体表达几十种不同类型的重组蛋白的产量均不低于对照pET-28a载体的表达量。(3)抑制蛋白cymR在T7强启动子(取代Pkm启动子)的作用下高表达，同时外源基因表达序列上游装入并列的两个cymR结合的cym-cmt操纵子序列P1-cuo和P2-cuo,这样有效地抑制了漏出表达，使得这一载体特别适合有毒蛋白的表达。(4)小分子诱导物Cumate水溶性好而且无毒，这一系统适用于生产大剂量的重组蛋白。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术采用原核生物His标签重组蛋白的表达系统，具有最经济、最方便和高产量等优点，解决了目前市场广泛使用的pET和PQE系列质粒载体都在大肠杆菌中的复制效率低和目的蛋白易漏出表达等缺陷。2、本专利技术构建的载体DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高拷贝高表达重组质粒，其特征在于：所述重组质粒由pUC ori复制启动子、Ampicillin抗性基因、cymR基因、T5启动子、cym‑cmt操纵子、多克隆位点和His标签组成；所述重组质粒的构建包括如下步骤：SS01采用质粒pcDNA3.1(‑)为模板，PCR扩增出含pUC ori复制启动子和Ampicillin抗性基因的片段pUC‑Amp，设计引物为：pcDNA‑5:TCGACCTCTAGCTAGAGCTTpcDNA‑3:TATATGGGCTATGAACTAASS02基因合成由cymR基因表达盒、T5启动子、cym‑cmt操纵子和多克隆位点组成的cumate诱导表达DNA序列cymR‑cuo；SS03通过无缝连接将SS01得到的pUC‑Amp和SS02得到的cymR‑cuo两片段连接环合为原核系统表达载体DN‑002；SS04以质粒pET‑28a为模板，PCR扩增出含T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列的DNA片段M‑His‑T，设计引物为：pET‑5:CGCCCATGGTAACTTTAAGAAGGAGATpET‑3:CGCCTCGAGATCCGGATATAGTTCCTCSS05将步骤SS04中的DNA片段M‑His‑T和步骤SS03中的质粒DN‑002用Nco I和Xho I进行双酶切，试剂盒纯化回收后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取重组质粒DN‑001，如SEQ ID NO1所示。...

【技术特征摘要】
1.高拷贝高表达重组质粒，其特征在于：所述重组质粒由pUCori复制启动子、Ampicillin抗性基因、cymR基因、T5启动子、cym-cmt操纵子、多克隆位点和His标签组成；所述重组质粒的构建包括如下步骤：SS01采用质粒pcDNA3.1(-)为模板，PCR扩增出含pUCori复制启动子和Ampicillin抗性基因的片段pUC-Amp，设计引物为：pcDNA-5:TCGACCTCTAGCTAGAGCTTpcDNA-3:TATATGGGCTATGAACTAASS02基因合成由cymR基因表达盒、T5启动子、cym-cmt操纵子和多克隆位点组成的cumate诱导表达DNA序列cymR-cuo；SS03通过无缝连接将SS01得到的pUC-Amp和SS02得到的cymR-cuo两片段连接环合为...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡春林，徐雪姣，
申请(专利权)人：安徽朵能生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34