【技术实现步骤摘要】
一种重组Vip3Aa蛋白的制备方法及其应用
本专利技术涉及一种重组Vip3Aa蛋白的制备方法及其应用，具体涉及一种诱导表达Vip3Aa/pET21b/BL21重组菌株制备Vip3Aa蛋白及其在德国小蠊和美洲大蠊防治中应用，属于生物防治领域。
技术介绍
Bt菌株可以在营养生长阶段合成一种杀虫蛋白，杀虫蛋白被称为营养性杀虫蛋白(vegetativeinsecticidalproteins，Vip)。Vips主要分为vip1，vip2和vip3，不同的vips蛋白具有不同的杀虫活性。Vip3蛋白是目前研究最多的Vip蛋白。Vip3Aa蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、烟夜蛾、小菜蛾、斜纹夜蛾和小地老虎等农作物害虫具有较高的杀虫活性。作用过程为：Vip3蛋白被中肠蛋白酶水解为活性蛋白，活性蛋白与上皮中肠细胞顶端特异性受体结合，形成孔道并破坏中肠细胞，导致昆虫死亡。Vip3Aa蛋白通过激发凋亡类型的细胞程序性死亡对敏感性昆虫具有毒杀效应。Vip3Aa蛋白在昆虫肠道内被水解为4种主要蛋白产物，其中只有一种蛋白水解产物(62KD)为Vip3Aa蛋白的毒性核心结构。Vip3Aa...
【技术保护点】
1.一种重组Vip3 Aa蛋白的制备方法，其具体包括下述步骤：1)Vip3 Aa基因的克隆：以Vip3 Aa DNA为模板，参考序列GenBank：L48811.1，Bacillus thuringienis strain AB88 insecticidal protein设计引物进行PCR反应，引入BamH I和Xho I酶切位点；2)Vip3 Aa/pET21b表达载体的构建和鉴定：将PCR产物和原核表达质粒pET21b分别采用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，采用DNA纯化回收试剂盒回收酶切片段，全波长分光光度计检测回收产物浓度并计算酶切片段摩尔数，以目...
【技术特征摘要】
1.一种重组Vip3Aa蛋白的制备方法，其具体包括下述步骤：1)Vip3Aa基因的克隆：以Vip3AaDNA为模板，参考序列GenBank：L48811.1，BacillusthuringienisstrainAB88insecticidalprotein设计引物进行PCR反应，引入BamHI和XhoI酶切位点；2)Vip3Aa/pET21b表达载体的构建和鉴定：将PCR产物和原核表达质粒pET21b分别采用限制性内切酶BamHI和XhoI进行双酶切，采用DNA纯化回收试剂盒回收酶切片段，全波长分光光度计检测回收产物浓度并计算酶切片段摩尔数，以目的基因：表达载体摩尔比为3：1，通过T4连接酶进行连接反应构建得到Vip3Aa/pET21b表达载体；3)Vip3Aa/pET21b/BL21重组菌株的获得向100μLE.coilBL21感受态中加入10μL提取鉴定为阳性的Vip3Aa/pET21b表达载体，轻弹混匀后冰上放置30min，金属浴42℃下热击90s，冰上放置1min后向其中加入900μlLB培养基，37℃下低速振荡培养1h-1.5h；5000rpm离心去上清，将沉淀使用200μLLB培养基吹打均匀，均匀涂布于氨苄筛选平板；连续培养16-18h后，挑取单菌落进行菌落PCR和酶切鉴定获得Vip3Aa/pET21b/BL21重组菌株；4)重组菌株的诱导表达挑取Vip3Aa/pET21b/BL21重组菌株单菌落接种于5ml含有100μg/ml氨苄的LB液体培养基中，37℃180rpm条件下震荡培养12-16h，将此菌液按1：100的比例接种于新鲜的LB液体培养基中，37℃180rpm条件下震荡培养至OD600值为0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，20℃，180rpm条件下继续震荡培养24h；5)Vip3Aa蛋白的分离纯化和冷冻干燥将诱导表达的Vip3Aa/pET21b/BL21重组菌株12000rpm离心10min，收集菌体，PBS洗涤离心；按每升培养液加入40mL比例加入裂解缓冲液(25mmol·L-1Tris-Cl，300mmol·L-1NaCl，5mmol·L-1β-巯基乙醇，pH8.0)悬浮菌体，加入PMSF和1％曲拉通X-100，采用超声细胞破碎仪破碎12min，细胞破碎后，12000rpm离心30min，取上清进行SDS-PAGE；Vip3Aa/pET21b菌株破碎后上清液采用0.22μM滤器过滤...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱家勇，刘文彬，金小宝，卢雪梅，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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