一种唾液蛋白样品的制备方法技术

一种唾液蛋白样品的制备方法，属于蛋白质样品制备技术领域，其特征在于包括以下步骤：１）收集唾液；２）将收集的唾液于４℃，８００ｇ离心１５ｍｉｎ，吸取上清液；３）加入体积浓度为０．０５％－５％的稀乙酸，混匀；４）４℃，１４０００ｇ离心６０ｍｉｎ，吸取上清液；５）将上清液放入透析袋中用双蒸水透析５ｈ；６）浓缩，得到唾液蛋白样品。本发明专利技术具有蛋白回收率高、制备时间短、安全无毒、增加低丰度蛋白上样量、图谱清晰易于分析等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属电泳蛋白质样品制备
，具体涉及一种有关全唾液蛋白质的制备 方法。
技术介绍
近年来，唾液的临床诊断价值逐渐为人们所认识。唾液通过非侵入方式获得、对机 体无创伤、可用于大样本筛查、利于纵向动态观察。因此，越来越多的临床工作者将唾液蛋 白质组学的策略应用于生理和病理状态下唾液蛋白质种类和功能的研究。但由于唾液中含 有大量粘蛋白，会造成蛋白质组学工作中样品制备的困难和分离分析的误差，影响实验重 复性。人类的唾液粘蛋白是蛋白质和碳水化合物的共价复合物，可分为两类，即高相对 分子质量粘蛋白(MGl)和低相对分子质量粘蛋白(MG2)。MGl分子量大于lOOOkDa，MG2分 子量为200-250kDa。此类糖蛋白具有优良的组织覆盖作用，以润滑、维持口腔粘膜完整性。 但由于唾液粘蛋白性质粘稠、含量丰富(约占总蛋白7% -20% )、分子量大，在唾液蛋白质 组样品制备和分离分析中，会造成实验误差，影响实验重复性。例如粘蛋白粘稠的性质会使 上样量产生误差；粘蛋白的大分子量会阻塞电泳凝胶孔径影响分离效果；粘蛋白作为一种 高丰度蛋白，会影响蛋白样品中其它低丰度蛋白的上样量。所以在唾液蛋白质组蛋白样品 制备过程中，必须给予去除。
技术实现思路
鉴于现有技术中存在的上述问题，本专利技术的目的在于提供一种唾液蛋白样品的制 备方法，主要通过稀乙酸沉淀去除粘蛋白而实现。所述的，其特征在于包括以下步骤1)收集唾液； 2)将收集的唾液于4°C，800g离心15min，吸取上清液；3)加入体积浓度为0. 05% -5%的 稀乙酸，混勻；4)4°C，14000g离心60min，吸取上清液；5)将上清液放入透析袋中用双蒸水 透析5h;6)浓缩，得到唾液蛋白样品。所述的，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸的体 积浓度为0. -0. 5%。所述的，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸的体 积浓度为0. 15%。所述的，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸体积 为步骤2)中吸取的上清液体积的1-4倍。所述的，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸体积 为步骤2)中吸取的上清液体积的2倍。所述的，其特征在于步骤6)所用的浓缩剂为聚乙 二醇 20000。本专利技术采用稀乙酸沉淀法去除粘蛋白后制备唾液蛋白样品，并与传统丙酮沉淀法 相比较，具有蛋白回收率高、制备时间短、安全无毒、增加低丰度蛋白上样量、图谱清晰易于 分析等优点，比丙酮沉淀法更有利于提高基于双向电泳-质谱技术路线唾液蛋白质组学的 稳定性、重复性。附图说明图1为稀乙酸沉淀法制备的唾液蛋白样品双向电泳银染图谱；图2为丙酮沉淀法制备的唾液蛋白样品双向电泳银染图谱。 具体实施例方式现结合本专利技术的实施例对本专利技术作进一步说明。以下实施例中，所用的药品和仪 器如下丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、甘氨酸、TRIS、CHAPS、SDS、碘乙酰氨、固相pH干 胶条(IPG strip pH4-7，24cm)等均为 GE healthcare 公司产品；2_D Quant Kit 蛋白定量 试剂盒购自Amersham Biosciences公司；透析袋(截留分子量3500)购自上海捷瑞生物工 程公司；冰乙酸、聚乙二醇(分子量20000)、丙酮为国产分析纯。UV8500双束紫外分光光度 仪购自HITACHI公司；EttanTM IPGphorTM等电聚焦电泳仪，EttanTM DALTSix垂直板电泳 仪,UMAX ImageScanner凝胶扫描仪,均购自 Amersham Biosciences 公司；VariοSkan Flash 全波长多功能酶标仪购自热电Thermo公司。实施例1、唾液样品收集6例唾液样品来源于本实验室健康女性研究生。年龄24 29岁。唾液收集时间 为上午9:00-12:00，收集前2h开始禁食水。用清水漱口后静坐于椅子上，前5min内的唾 液自然吞下后开始收集，口腔唾液积聚至一定量后，将其吐入放置于冰浴中的50ml离心管 内，共采集唾液样品6ml (每组3ml)，采集时间为5-lOmin。实施例2、唾液蛋白样品制备与测定方法一将实施例1中收集的样品离心15min(4°C，800Xg)，吸取上清，加入两倍 体积0. 15%的稀乙酸，混勻，再次离心60min(4°C，14000Xg)，吸取上清液，放入透析袋中 用双蒸水透析5h，然后应用聚乙二醇20000浓缩至300 μ 1左右。方法二 将实施例1中收集的样品离心15min(4°C，800Xg)，吸取上清，再次离心 60min(4°C，14000Xg)，吸取上清液，取预冷至4°C的丙酮，按照4 1的比例(丙酮样 品)，倒入样品中，混勻，-20 V保存24h后，取出样品，离心60min (4°C，14000 X g)，弃上清， 可见离心管底部有白色绵絮状物质，用300 μ 1裂解液(30mmOl/LTris-HCl，8mOl/L尿素， 4% CHAPS, pH8. 5)溶解沉淀。将方法一和方法二制备的样品蛋白用2-D Quant Kit蛋白定量试剂盒测定蛋白质 浓度。总质量=蛋白样品浓度X总体积。总时间=从第一步离心开始到300μ1蛋白样品 制备完成的时间。双向凝胶电泳实验分别将方法一和方法二制备的样品和水化液(8mol/L尿素， 2% CHAPS, 13mmol/LDTT,0. 5% IPG buffer, 0. 002%溴酚蓝)混合后共 450ul (每块胶总蛋 白上样量为300 μ g)，采用胶内泡涨的方法上样。等电聚焦参数30V，12h ；500V, Ih ； 1000V, Ih ；8000V, 8h。等电聚集后，胶条于平衡液1 (1 % DTT，50mmol/LTris-cl, 6M尿素，30 %甘油，2% SDS，0. 002%溴酚蓝)、平衡液2(4%碘乙酰氨，50謹01/1!^8(1，611尿素，30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚蓝)中各平衡15min后转移到第二向12. 5 % SDS-PAGE胶上，用0. 5 %琼 脂糖封顶，进行第二向电泳，参数设定为10W，45min ；40W，6h。直到溴酚蓝染料迁移至胶的 底部边缘结束电泳。取出凝胶转移到染色盒里进行硝酸银染色，使用UMAX ImageScarmer凝胶扫描仪 及LabScan软件进行扫描。采用SPSS 16. 0统计软件处理，所有数据采用均数士标准差(Z 士S)表示，均数 比较用t检验作两组组间比较。实验结果如下稀乙酸沉淀法制备得到的蛋白总质量显著高于丙酮沉淀法，而提取蛋白总时间显 著低于丙酮沉淀法。相关的数据见表1。表1.两种蛋白制备方法蛋白质总质量及总时间的比较(n = 6,X 士S) 注与丙酮沉淀法比较:*P < 0.05，**P <0.01。由表1中可以看出，稀乙酸沉淀法的蛋白提取率与蛋白提取时间均显著优于丙酮 沉淀法。两种方法蛋白回收率的差异可能是由于丙酮作为一种有机溶剂在沉淀蛋白时可能 并不完全，部分蛋白质可能仍留在上清液中被去除而损失；0. 15%的稀乙酸在沉淀粘蛋白 的同时，对溶液中其它蛋白质并无影响。由图1中也可以看出稀乙酸沉淀法组蛋白质点数 要明显多于丙酮沉淀法组，特别是在凝胶左下角(酸性端、低分子量区)，而丙酮沉淀法组 凝胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：１）收集唾液；２）将收集的唾液于４℃，８００ｇ离心１５ｍｉｎ，吸取上清液；３）加入体积浓度为０．０５％－５％的稀乙酸，混匀；４）４℃，１４０００ｇ离心６０ｍｉｎ，吸取上清液；５）将上清液放入透析袋中用双蒸水透析５ｈ；６）浓缩，得到唾液蛋白样品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范永升，温成平，丁慧登，卢德赵，曲建全，谢志军，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]