本发明专利技术公开了一种小窝蛋白‑1脚手架区融合多肽的制备方法及其应用，属于生物医药领域。本发明专利技术的多肽的氨基酸序列为DGIWKASFTTFTVTKYWFYRRQIKIWFQNRRMKWKK，是通过微波辅助固相合成方法得到。该多肽具有抗炎作用，能够明显降低炎症环境中原代培养的大鼠巨噬细胞和肺组织中白介素‑1、肿瘤坏死因子‑α、单核细胞趋化蛋白‑1和诱导型一氧化氮合酶等各种促炎症因子的表达，可作为在制备抗炎药物中的应用。
【技术实现步骤摘要】
一种小窝蛋白-1脚手架区融合多肽的制备方法及其应用
本专利技术涉及一种小窝蛋白-1脚手架区融合多肽的制备方法及其应用，属于生物医药领域。
技术介绍
有各种感染疾病诱发的急性肺损伤及其严重阶段的急性呼吸窘迫综合症，发病率高，并且目前尚无有效治疗药物故死亡率也极高。因此研发有效治疗急性肺损伤疾病的药物是具有非常重要的临床意义。小窝蛋白-1是细胞膜小窝的重要组成蛋白，其第82～101位氨基酸被称为小窝蛋白-1脚手架区在细胞信号转导、跨膜物质转运等生物学功能发挥重要作用。最近的研究表明，利用腺病毒或者慢病毒为载体能够治疗各种肝、肺和肾脏等脏器纤维化疾病。但由于基因治疗所用载体腺病毒或者慢病毒具有诸如费用昂贵、操作复杂、诱导宿主免疫反应和潜在的致病风险等严重缺陷，无法在医院广泛推广。最近的研究发现小窝蛋白-1脚手架区能够替代小窝蛋白-1的功能，同样具有多种治疗作用。生物活性多肽作为药物具有其独特的优点：首先，分子量小，无免疫原性，比较安全：其次，结构相对简单，功能较明确，特异、副作用小；第三，分子小，易于合成，结构易于改造，生产成本低；第四，多肽药物易于从多途径吸收，因此给药途径可多样化(如口服、喷雾、透皮吸收等)；第五，合成的多肽纯度较高，不存在热源问题。正因为如此，国内外对多肽药物的研究特别重视。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了具有抗炎作用的小窝蛋白-1脚手架区融合多肽及其制备方法，以及融合多肽在制备抗炎药物方面的应用。本专利技术的第一个目的是提供一种具有抗炎作用的小窝蛋白-1脚手架区融合多肽，所述多肽的氨基酸序列为DGIWKASFTTFTVTKYWFYRRQIKIWFQNRRMKWKK(序列如SEQIDNO:1所示)。本专利技术的第二个目的是提供编码所述多肽的核苷酸序列。本专利技术的第三个目的是提供一种抗炎药物，所述抗炎药物以氨基酸序列为SEQIDNO:1所示的多肽作为有效成分或者主要有效成分。在一种实施方式中，所述药物中还包括药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。在一种实施方式中，本专利技术的多肽可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。在一种实施方式中，本专利技术的药物可配制成若干种剂型，其中含有药学领域中常用的一些赋形剂；例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。在一种实施方式中，用于本专利技术药物的载体是药学领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。本专利技术的第四个目的是提供一种所述多肽的制备方法。在一种实施方式中，所述多肽是采用微波辅助固相合成法制备得到的。在一种实施方式中，所述多肽的制备方法，以吡啶/二甲基甲酰胺为溶剂，苯丙三氮唑/二四甲基脲六氟磷酸酯为缩合试剂，反应物浓度为0.113mmol/L，反应时间为4分钟，反应温度为20℃。此时脚手架区多肽的产率最高，为87.7％，纯度为97％。在一种实施方式中，所述多肽的制备方法，是先制备Fmoc-Tyr(t-Bu)-wang树脂并封闭未反应羟基，然后采用微波辅助脱除Fmoc保护基，再微波辅助缩合Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H反应，按照脚手架区多肽中氨基酸从羧基到氨基端的顺序，重复缩合和脱保护两步反应，合成脚手架区多肽。在一种实施方式中，所述多肽的制备方法，包括下列步骤：1)Fmoc-Tyr(t-Bu)-wang树脂的制备及未反应羟基的封闭称量wang树脂置于反应器中，加入二氯甲烷溶胀树脂，抽滤脱去二氯甲烷溶剂，将Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H连接到树脂上；分别加入二氯甲烷，甲醇和二甲基甲酰胺各洗涤树脂三次；向上面得到的树脂中加入乙酸酐和吡啶，反应2h；最后加入二氯甲烷和甲醇各漂洗树脂以封闭未反应羟基。2)微波辅助脱除Fmoc保护基将上一步得到的Fmoc-Tyr(t-Bu)-wang树脂置于反应管中，然后加入哌啶/二甲基甲酰胺溶液，反应在微波反应器中进行，时间为6min-10min；3)微波辅助缩合Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H反应称量Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H，Ⅳ-羟基-7-偶氮苯丙三氮唑和羟基一苯并三氮唑，其中氨基酸过量1倍，用适量的二甲基甲酰胺溶解；然后加入到树脂中，同时加入的二异丙基乙基胺，微波辐射下反应；然后抽滤掉反应液，分别加入二氯甲烷、甲醇和二甲基甲酰胺各洗涤3次；4)肽链的延长按照脚手架区多肽中氨基酸从羧基到氨基端的顺序，重复缩合和脱保护两步反应，合成脚手架区多肽，此过程中各个氨基酸的过量倍数均为1倍。本专利技术还要求保护表达所述多肽的转基因细胞系、含有编码所述多肽的载体、含有编码所述多肽的宿主等等。本专利技术的优点和效果：本专利技术制备得到的小窝蛋白-1脚手架区多肽纯度大于97％，产量达到87.7％。体外实验和体内实验表明，该多肽能够明显降低炎症环境中原代培养的大鼠巨噬细胞和小鼠肺组织中白介素-1、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1和诱导型一氧化氮合酶等各种促炎症因子的表达，从而达到抗炎的目的。具体实施方案下面的实例将具体说明本专利技术的操作方法，但不能作为对本专利技术的限定。实施例1：微波辅助固相合成小窝蛋白-1脚手架区多肽的具体主要操作步骤(1)Fmoc-Tyr(t-Bu)-wang树脂的制备及未反应羟基的封闭称量wang树脂2g置于反应器中，加入二氯甲烷15mL溶胀树脂30min，抽滤脱去二氯甲烷溶剂，将Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H连接到树脂上。反应结束后，分别加入二氯甲烷，甲醇和二甲基甲酰胺各2mL各洗涤树脂三次。未反应羟基的封闭：向上面得到的树脂中加入乙酸酐和吡啶，反应2h。反应结束后，加入二氯甲烷和甲醇各漂洗树脂3次。(2)微波辅助脱除Fmoc保护基将0.1mmolFmoc-Tyr(t-Bu)-wang树脂置于反应管中，然后加入2ml20％哌啶/二甲基甲酰胺溶液，反应在微波反应器中进行，时间为6min-10min。反应结束后，分别加入二氯甲烷、甲醇和二甲基甲酰胺各2mL洗涤树脂3次。(3)微波辅助缩合反应1)缩合Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H称量Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H0.1g，Ⅳ-羟基-7-偶氮苯丙三氮唑0.1g和羟基一苯并三氮唑0.23g，氨基酸过量1倍，用二甲基甲酰胺溶解。然后加入到树脂中，同时加入0.34mmol的二异丙基乙基胺，微波辐射下反应；然后抽滤掉反应液，分别加入二氯甲烷、甲醇和二甲基甲酰胺各2mL洗涤树脂3次。2)肽链的延长按照脚手架区多肽中氨基酸从羧基到氨基端的顺序，重复缩合和脱保护两步反应，合成脚手架区融合多肽，此过程中各个氨基酸的过量倍数均为1倍。最终得到以吡啶/二甲基甲酰胺为溶剂，苯并三氮唑/二四甲基脲六氟磷酸酯为缩合试剂，反应物浓度为0.113mmol/L，反应时间为4分钟，反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种融合多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:1所示的序列。2.编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列。3.一种抗炎药物，其特征在于，所述抗炎药物以氨基酸序列为SEQIDNO:1所示的多肽作为有效成分或者主要有效成分。4.根据权利要求1所述的抗炎药物，其特征在于，所述药物中还包括药学上能够接受的赋型剂。5.根据权利要求1所述的抗炎药物，其特征在于，所述药物为口服制剂、能注射的制剂或者局部制剂。6.根据权利要求1所述的抗炎药物，其特征在于，所述药物为治疗严重脓毒血症引起的相关脏器损伤疾病的药物。7.一种权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于，所述方法是采用微波辅助固相合成法制备得到权利要求1所述多肽。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法，以吡啶/二甲基甲酰胺为溶剂，苯丙三氮唑/二四甲基脲六氟磷酸酯为缩合试剂，反应物浓度为0.113mmol/L，反应时间为4分钟，反应温度为20℃。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法，是先制备Fmoc-Tyr(t-Bu)-wang树脂并封闭未反应羟基，然后采用微波辅助脱除Fmoc保护基，再微波辅助缩合Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H反应，按照脚手架区多肽中氨基酸从羧基到氨基端的顺序，重复缩合和脱...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊良，翁平，庞庆丰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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