基于乙型肝炎核心抗原的疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种蛋白，其包括乙型肝炎核心抗原（HBcAg）和流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段。本发明专利技术还提供了一种蛋白，其包括乙型肝炎核心抗原（HBcAg）和流感病毒血凝素（HA）或其免疫原性片段。本发明专利技术还提供了由所述蛋白形成的颗粒、编码所述蛋白的核酸分子、用于制备所述蛋白的方法、包含所述蛋白的药物组合物以及所述蛋白用于在对象中诱导免疫反应的应用。

Vaccine based on hepatitis B core antigen

The present invention provides a protein comprising a hepatitis B core antigen (HBcAg) and a influenza virus A surface polypeptide M2 or an immunogenic fragment thereof. The present invention also provides a protein comprising a hepatitis B core antigen (HBcAg) and influenza virus hemagglutinin (HA) or an immunogenic fragment thereof. The invention also provides by the formation of protein particles, encoding the protein nucleic acid molecules, for the preparation of the protein, containing the protein drug composition and the protein for inducing immune response in the object application.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于乙型肝炎核心抗原的疫苗
本专利技术涉及包含乙型肝炎核心抗原（HBcAg）和流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段的蛋白。本专利技术还涉及由所述蛋白形成的颗粒、编码所述蛋白的核酸分子、制备所述蛋白的方法、包含所述蛋白的药物组合物以及所述蛋白用于在对象中诱导免疫反应的用途。
技术介绍
乙型肝炎（HepatitisB）病毒核心（HBc）蛋白具有某种程度上的独特结构，它由两个反平行的α螺旋组成，其形成特有的“穗（spike）”结构。然后两个HBc分子自发地二聚化以形成双穗束。该双穗束是病毒样颗粒（VLP）的构成部件。VLP是具有吸引力的疫苗系统，因为它们的高度重复的性质递送抗原的多个拷贝。进一步地，病毒核酸的缺乏使得它们成为安全的载体。HBc作为疫苗载体是特别有趣的，因为它具有几个可能让抗原序列插入的位点。然后HBc的极端免疫原性也赋予被插入的序列，因此使得其也具有过度的免疫原性。最佳的插入位点是主要插入区域（MIR）。然而，先前表明，当较大的或疏水性的序列被插入MIR时，则单体的HBc不能二聚化且VLP没有形成（Pumpen&Grens2001），因此使疫苗无效。流感病毒是正粘病毒科的成员。存在命名为A、B和C的三种亚型的流感病毒会感染人类。流感病毒粒子包含分段的负链RNA基因组。包膜的流感A病毒粒子具有：三个膜蛋白，血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和质子离子通道蛋白（M2）；基质蛋白（M1），刚好在脂双层之下；核糖核蛋白核心，由8个病毒RNA片段和三个蛋白（聚合酶酸性蛋白（PA）、聚合酶碱性蛋白1（PB1）和聚合酶碱性蛋白2（PB2））组成；以及非结构蛋白2（NS2）。流感B病毒粒子具有在包膜中的四个蛋白：HA、NA、NB和BM2。与流感A病毒的M2蛋白相似，BM2蛋白是对于脱壳过程至关重要的质子通道。NB蛋白被相信是离子通道，但是它对于细胞培养中的病毒复制是不需要的。流感C病毒有些不同。与流感A和B病毒相似，流感C病毒的核心由核糖核蛋白组成，它由病毒RNA和四个蛋白组成。如同在流感A和B病毒粒子中一样，M1蛋白刚好位于膜之下。小病毒包膜蛋白是CM2，作为离子通道。主要流感C病毒包膜糖蛋白被称为HEF（血凝素-酯酶-融合物），因为它同时具有HA和NA的功能。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，负责病毒附着和病毒颗粒渗透进细胞，并且是病毒中和以及保护性免疫力的免疫显性表位。但是，这些蛋白能够并且常常在菌株之间发生变化。由于这两个蛋白的可变性，广谱的、长效的流感疫苗迄今尚未被开发。常用的流感疫苗几乎每年都必须进行调整，以遵循病毒的抗原漂移。当在病毒中发生更多的急剧变化（被称为抗原转移）时，疫苗就不再有保护性。专利技术概述本专利技术涉及一种基于乙型肝炎（HBV）核心蛋白的疫苗递送系统。当前的对于流感病毒的疫苗要求它们每年都被重新设计，这是因为病毒的快速突变率造成了不被包含在先前年份的疫苗中的逃脱变种的出现。它们依赖于预测主要的流行性流感菌株，但是它们在疫苗和流行性菌株之间存在不匹配的时候变得不理想。此外，它们不能防范新型的、先前未见过的病毒菌株。一个解决方案是设计基于流感的保守的蛋白结构域的疫苗，这些结构域每年都保持大体不变并且在新出现的变种中是保守的。靶定保守结构域的许多先前的尝试都失败了，因为这些区域的自身的免疫原性低或者不能在野生型病毒之外以它们的天然构象呈现。专利技术人已经设法将来自流感病毒A表面多肽M2（流感基质蛋白2）的保守区域插入进串联构建体。所述保守区域是流感病毒A表面多肽M2胞外域（M2e）。得到的VLP能够产生对相关的M2肽的血清转化，并且提供对致死性H1N1流感感染的保护（见实施例1）。专利技术人还已经设法将来自流感血凝素（HA）的保守区域插入进串联构建体。得到的VLP能够产生对HA蛋白的血清转化，并且提供对致死性同源H1N1流感感染的保护（见实施例2）。进一步地，专利技术人还已经设法将来自流感血凝素（HA）和基质2蛋白胞外域（M2e）的保守区域同时插入进串联构建体。得到的VLP能够产生对HA蛋白和M2e肽的血清转化，并且提供对致死性同源H1N1流感感染的保护（见实施例3）。专利技术人还制造了包含两种不同的VLP的疫苗：包括来自流感HA和M2e的保守区域的第一种VLP的串联构建体；以及包括来自源于流感的不同亚型的流感HA的保守区域的第二种VLP的串联构建体。这两种VLP一共包括5个来自流感的保守抗原，并且可以作为单一的疫苗而被同时递送。该组合疫苗能够产生对组-1和组-2HA蛋白、以及M2e肽的血清转化，并且提供对致死性H1N1和H3N2流感感染的保护（见实施例4）。专利技术人发现，将原生的M2e插入进el环会使得VLP不能正确地形成，这是因为存在蛋白错误折叠。专利技术人意外地发现，可以通过加入在M2e插入体侧翼的接头序列、和/或通过使用替代的氨基酸取代位于M2e的第17和19位的两个半胱氨酸残基中的一个或两个，解决上述问题。所述接头允许VLP的形成，它能够诱导血清转化并且提供对致病性挑战的保护。例如，实施例1中的表2的第1和第4列证明了，将接头引入M2e和el环之间形成了能够诱导血清转化的VLP。因此，所述接头提供了将M2e插入进串联构建体的方法，而如果没有接头，会导致错误折叠并且因此会不能产生在诱导免疫反应上有效的VLP。下文进一步讨论的是可以被结合进串联构建体中的免疫原性多肽的例子。特别地，当前的专利技术人已经发现，包含流感病毒A表面多肽M2胞外域和/或血凝素（HA）的茎（stalk）区域的串联构建体产生VLP，该VLP在诱导血清转化和提供对流感挑战的保护上特别有效（见实施例）。在M2e的第17和/或19位使用丝氨酸取代半胱氨酸允许VLP的形成，该VLP能够诱导血清转化并提供对致病性挑战的保护。如果没有取代一个或两个半胱氨酸，则VLP不会正确地形成，除非如上所述地将接头插入M2e插入体和el环之间。例如，实施例1中的表2的第1至第3列证明了，在第17和/或19位使用丝氨酸取代半胱氨酸能够形成VLP，该VLP能够诱导血清转化，而在使用具有在第17和19位的原生半胱氨酸的VLP时不存在血清转化。据认为，半胱氨酸残基的取代的存在防止了二硫键的形成，它可能干扰VLP的形成。因此，本专利技术提供了一种蛋白，其包括串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝，其中HBcAg的拷贝的一个或两个包括在el环中的流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段。所述流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段在一侧或两侧的侧翼有接头，所述接头将所述多肽或片段连接至HBcAg序列。本专利技术还提供了一种蛋白，其包括串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝，其中HBcAg的拷贝的一个或两个包括在el环中的流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段，并且在所述流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段的第17和/或19位的半胱氨酸氨基酸被删除或者被替代的氨基酸取代。本专利技术的蛋白还可以包括在HBcAg的另一个拷贝中的另一种免疫原性多肽。该免疫原性多肽可以衍生自流感。但是，它也可以衍生自不同的病原体或过敏原。因此，本专利技术的蛋白可以用于诱导对流感病毒的免疫反应（取决于存在何种其他的免疫原性多肽），它还可以用于同时诱导对不同的病原体或过敏原的免疫反应。专利技术人还发现，可以通过将抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，其包括串联的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的第一拷贝和第二拷贝，其中HBcAg的拷贝的一个或两个包括在el环中的流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段，所述流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段在一侧或两侧的侧翼有接头，所述接头将所述多肽或片段连接至HBcAg序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.05 GB 1421692.31.一种蛋白，其包括串联的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的第一拷贝和第二拷贝，其中HBcAg的拷贝的一个或两个包括在el环中的流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段，所述流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段在一侧或两侧的侧翼有接头，所述接头将所述多肽或片段连接至HBcAg序列。2.根据权利要求1所述的蛋白，其中在所述流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段的第17和/或19位的半胱氨酸氨基酸被删除或者被替代的氨基酸取代。3.一种蛋白，其包括串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝，其中HBcAg的拷贝的一个或两个包括在el环中的流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段，并且在所述流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段的第17和/或19位的半胱氨酸氨基酸被删除或者被替代的氨基酸取代。4.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中HBcAg的一个拷贝包括在el环中的流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段，并且HBcAg的另一个拷贝包括另一种免疫原性多肽。5.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中所述蛋白包括以下部件：[HBcAg的第一拷贝的对于el环是N末端的部分]-[第一接头]-[流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段]-[第二接头]-[HBcAg的第一拷贝的对于el环是C末端的部分]-[第三接头]-[HBcAg的第二拷贝的对于el环是N末端的部分]-[另一种免疫原性多肽]-[HBcAg的第二拷贝的对于el环是C末端的部分]。6.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中所述蛋白包括以下部件：[HBcAg的第一拷贝的对于el环是N末端的部分]-[第一接头]-[流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段]-[第二接头]-[HBcAg的第一拷贝的对于el环是C末端的部分]-[第三接头]-[HBcAg的第二拷贝的对于el环是N末端的部分]-[第四接头]-[另一种免疫原性多肽]-[第五接头]-[HBcAg的第二拷贝的对于el环是C末端的部分]。7.根据权利要求4至6的任一项所述的蛋白，其中所述另一种免疫原性多肽是流感病毒多肽或其免疫原性片段。8.根据权利要求7所述的蛋白，其中所述流感病毒多肽或其免疫原性片段是血凝素（HA）或其免疫原性片段，其中HA的所述片段任选地是HA茎区域。9.根据权利要求1至3的任一项所述的蛋白，其中HBcAg的一个拷贝包括在el环中的流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段，并且HBcAg的另一个拷贝包括在el环中的小于20个氨基酸的序列。10.根据权利要求9所述的蛋白，其中HBcAg的第二拷贝包括在el环中的赖氨酸（K）残基，所述赖氨酸（K）残基在每侧的侧翼有包括甘氨酸和丝氨酸残基的接头序列。11.根据权利要求9或10所述的蛋白，其中所述蛋白包括以下部件：[HBcAg的第一拷贝的对于el环是N末端的部分]-[第一接头]-[流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段]-[第二接头]-[HBcAg的第一拷贝的对于el环是C末端的部分]-[第三接头]-[HBcAg的第二拷贝的对于el环是N末端的部分]-[第四接头]-[赖氨酸（K）残基]-[第五接头]-[HBcAg的第二拷贝的对于el环是C末端的部分]。12.根据权利要求9至11的任一项所述的蛋白，其中HBcAg的第二拷贝包括在el环中的序列GSGSGGGKGGGSGS(SEQIDNO:21)。13.根据权利要求2至12的任一项所述的蛋白，其中在所述流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段的第17和/或19位的所述替代的氨基酸是丝氨酸。14.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中在所述el环或每个el环中存在流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段的一个以上拷贝。15.根据权利要求14所述的蛋白，其中在所述el环或每个el环中存在流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段的2至5个拷贝。16.根据权利要求14所述的蛋白，其中在所述el环或每个el环中存在流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段的3个拷贝。17.根据权利要求14至16的任一项所述的蛋白，其中在流感病毒A表面多肽M2或其免疫原性片段的每个拷贝之间存在接头。18.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中流感病毒A表面多肽M2的所述免疫原性片段是流感病毒A表面多肽M2胞外域（M2e）。19.根据权利要求18所述的蛋白，其中在所述el环或每个el环中的M2e的所述拷贝或每个拷贝是通用M2e共识序列或者具有多达6个氨基酸取代、添加或缺失的通用M2e共识序列。20.根据权利要求19所述的蛋白，其中在所述el环或每个el环中存在M2e的三个拷贝，并且第一拷贝是通用M2e共识序列，第二拷贝是在H3N2或H7H7中发现的常见的变种，并且第三拷贝是在H5N1中发现的常见的变种。21.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中HBcAg的串联拷贝通过接头连接。22.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中：（a）所述接头或每个接头的长度为至少1.5nm；和/或（b）所述接头或每个接头包括序列GlynSer(GnS)的一个或多个拷贝，其中n为2至8。23.根据权利要求22所述的蛋白，其中所述接头...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·安东尼·惠兰，亚历杭德罗·拉米雷斯·塞瓦略斯，文森索·克雷申特，
申请(专利权)人：IQUR有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB