腈水解酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种腈水解酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位，第339位和第343位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。本发明专利技术经过蛋白质分子改造，腈水解酶AcN纯酶的热稳定性最高提高了14倍，且利用含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌在高温下(45℃)水解1‑氰基环己基乙腈，反应时间缩短为原来的三分之一。因此，本发明专利技术所获得的突变体在高效催化1‑氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1‑氰基环己基乙酸中具有良好的应用前景。

Nitrile hydrolase mutants and uses thereof

The invention discloses a nitrilase mutant and its application, the mutant is SEQ ID No.2 the amino acid sequence of 201st, 339th and 343rd amino acid in one or more mutations were obtained. The present invention after protein molecular modification, the thermal stability of nitrilase AcN pure enzyme increased 14 times, and the use of recombinant Escherichia coli containing nitrilase mutant at high temperature (45 DEG C) hydrolysis of 1 cyano cyclohexyl acetonitrile, the reaction time is shortened to 1/3 of the original. Therefore, the invention of the obtained mutants has good application prospect in high catalytic 1 cyano cyclohexyl acetonitrile synthesis of gabapentin intermediate 1 cyano cyclohexyl acetic acid.

【技术实现步骤摘要】
腈水解酶突变体及其应用(一)
本专利技术涉及一种来源于敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis)CCTCCNO:M209044腈水解酶的突变体及其在抗癫痫药物中间体1-氰基环己基乙酸合成中的应用。(二)
技术介绍
加巴喷丁是美国Warner-Lambert公司首先开发的抗癫痫药，与目前使用的同类产品相比，具有口服吸收快，耐受性好，毒副作用小，治疗效果好，在体内不代谢，不与血浆蛋白结合，不诱导肝酶，能够穿过人体大脑的血脑屏障，与其他抗癫痫病药物相互作用的可能性很低，作为难治性癫痫病的叠加用药作用尤为突出。1-氰基环己基乙酸(1-Cyanocyclohexaneaceticacid)是合成新一代抗癫痫药物加巴喷丁(Gabapentin)的关键中间体，市场前景非常广阔。目前，用于合成加巴喷丁包括其关键中间体1-氰基环己基乙酸全部采用化学合成技术，生产过程中存在三废排放量大，环境污染严重，三废处理成本高等问题。腈水解酶(NitrilaseEC3.5.5.1)是一种能将腈类物质(含有-CN)水解为相应羧酸的酶。腈水解酶催化反应具有高效性、高选择性、反应条件温和、环境污染小、成本低等特点，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位，第339位和第343位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。

【技术特征摘要】
1.一种腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第201位，第339位和第343位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。2.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：(1)将SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第201位苏氨酸突变为苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸；(2)将SEQIDNo.2所示氨基酸序列第339位谷氨酰胺突变为赖氨酸；(3)将SEQIDNo.2所示氨基酸序列第343位谷氨酸突变为赖氨酸；(4)将SEQIDNo.2所示氨基酸序列第201位的苏氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第339位和第343位谷氨酸突变为赖氨酸。3.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因。4.一种由权利要求3所述编码基因构建的重组载体。5.一种由权利要求4所述重组载体转化获得的重组基因工程菌。6.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在催化双腈化合物制备单氰基羧酸化合物中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用以含腈水解酶突变体编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞或者湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以双腈化合物为底物，以pH＝7.0、200M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为反应介质构成反应体系，45℃恒温水浴反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得单氰基羧酸化合物；所述双腈化合物为1-氰基环己基乙腈、丙二腈或丁二腈。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物终浓度以缓冲液体积计为100～1000mM，所述催化剂用量以湿菌体重量计为10～100g/L缓冲液。9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，郑裕国，徐喆，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33