一株定点突变改造的基因工程精氨酸脱亚胺酶制造技术

一株定点突变改造的基因工程精氨酸脱亚胺酶，属于基因工程技术领域。其氨基酸序列为SEQ ID No.1。所述定点突变的精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列相对于天然的精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列的第264位甘氨酸突变为脯氨酸。本发明专利技术所述的突变精氨酸脱亚胺酶与野生酶相比其有效pH作用范围得到一定的扩展，尤其在生理pH 7.4下仍具有较好的酶活性。随着有效pH作用范围的拓宽，突变酶在pH 5.5~7.5条件下，仍然具有较高的稳定性。因此解决了精氨酸脱亚胺酶在临床上对肿瘤治疗的应用上生理条件下普遍酶活力低、体内半衰期短的问题，为利用该酶及其编码基因来用于临床治疗创造好的条件。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种最适pH和pH稳定性向生理中性偏移的精氨酸脱亚胺酶突变体，属于基因工程

技术介绍
精氨酸脱亚胺酶（Argininedeiminase，EC3.5.3.6）简称ADI，它催化在微生物体内的精氨酸代谢途径中的第一个反应，即将精氨酸水解，并生成瓜氨酸和氨。精氨酸脱亚胺酶来源广泛，目前在细菌、古细菌及一些真核细胞中均有发现。同时，不同来源的精氨酸脱亚胺酶的性质有较大的差异。目前，国内外研究精氨酸脱亚胺酶的学者主要将该酶应用于瓜氨酸的制备和疾病的治疗两大方面。其中医药领域上，精氨酸脱亚胺酶在抑制精氨酸缺陷性肿瘤、乳腺癌、肝癌细胞以及作为L-天冬酰胺酶的替代品治疗白血病方面具有良好的表现。美国凤凰公司研制的ADI-PEG-20已在全球进行肝癌的第Ⅲ期人体临床试验，结果表明ADI-PEG-20可使患者平均寿命延长76%。迄今为止，由于作为药用酶受到在生理条件下酶活低、体内半衰期短、底物亲和性弱等问题的限制，精氨酸脱亚胺酶仍未大规模应用。因此通过分子改造以改善酶学性质尤为重要。定点突变（sit-directedmutagenesis）是分子改造中的一种主要手段之一，是指在目的DNA片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。与其他改善酶学性质的策略相比，定点突变具有更为迅速、直接和节约成本的优势，它是实验室常用的基因改造的手段之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，通过对精氨酸脱亚胺酶进行分子改造，使改造后的精氨酸脱亚胺酶在生理pH7.4条件下的酶活和稳定性有所提高，最终应用于医药领域。本专利技术的技术方案：一种定点突变改造的精氨酸脱亚胺酶突变体，称之为基因工程精氨酸脱亚胺酶，由粪肠球菌EnterococcusfaecalisSK32.001的精氨酸脱亚胺酶基因出发，运用定点突变技术获得，所述的精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNo.1，定点突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的基因DNA，是由SEQIDNo.2的核苷酸序列所编码。一种重组质粒，其包含了所述的DNA分子。一种宿主细胞，其含有所述的DNA分子，或含有所述的重组质粒。所述的精氨酸脱亚胺酶突变体，将含有通过B-FITTER预测获得的氨基酸突变点的精氨酸脱亚胺酶突变质粒转入大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)宿主中，构建突变体，进行序列验证确认，得到最适pH和pH稳定性趋近与生理中性pH7.4的突变体Gly264Pro。其第264位甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro。所述的精氨酸脱亚胺酶突变体的构建方法，包括如下步骤：以来自于大肠杆菌宿主携带的精氨酸脱亚胺酶基因的重组质粒为模版，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进行反向PCR，扩增突变质粒全长；使用DpnⅠ限制性内切酶进行消化；取经过DpnⅠ限制性内切酶处理的PCR产物热机转化EcoliDH5α，涂布于含有卡那霉素抗性的固体LB培养基上培养；挑取固体LB培养基上的单菌落，接入含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，提取质粒，测序；将测序结果正确的质粒转化入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，获得突变体基因工程精氨酸脱亚胺酶。所述精氨酸脱亚胺酶突变体的应用，所述的精氨酸脱亚胺酶突变体用于药用抗肿瘤活性及相关药理活性研究。所述的氨基酸发生突变位于精氨酸脱亚胺酶蛋白结构的内部，所述的突变可以增加蛋白疏水相互作用。所述的氨基酸发生突变的是精氨酸脱亚胺酶第264位的甘氨酸替换为脯氨酸，所得单突变体命名为Gly264Pro。本专利技术提供一种所述精氨酸脱亚胺酶突变体的构建方法，具体步骤如下：1、构建一株以pET-28a-c(+)为表达载体、在表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）中表达的精氨酸脱亚胺酶基因工程重组菌；2、设计突变引物，通过反向PCR对精氨酸脱亚胺酶基因进行定点突变，获得含突变精氨酸脱亚胺酶基因序列的重组载体；3、将突变后的重组载体通过热激转化进入大肠杆菌BL21（DE3）中，并诱导表达，收集菌体，超声破碎细胞后使用Ni-NTA进行蛋白分离纯化，获得突变精氨酸脱亚胺酶。本专利技术提供的精氨酸脱亚胺酶突变体最适pH和pH稳定性均向生理中性方向偏移，其中最适pH从原始的5~5.5，扩大为5.5~7.5，pH稳定范围从5.5~6.5，偏移到6.5~7.5。解决了野生型的精氨酸脱亚胺酶在生理pH7.4条件下催化活性和稳定性低的问题，为该酶在医药领域的应用创造好的条件。本专利技术所用的精氨酸脱亚胺酶的基因arcA来自于一株可生产瓜氨酸的粪肠球菌，该菌株编号CCTCCNO:M2011465，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，命名为SK32.001（EnterococcusfaecalisSK32.001），在中国专利CN102433290A中已经公布。附图说明图1：重组质粒pET-28a-ADI的构建图谱。图2：野生酶和突变酶的最适pH变化图。图3：野生酶和突变酶的pH稳定性变化图。具体实施方式以下通过实施例来进一步阐明本专利技术，下列实施例用于说明目的而非用于限制本专利技术范围。材料与试剂：所用的限制性内切酶、SolutionⅠ连接酶、PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、琼脂糖纯化试剂盒、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）菌株、引物均购于生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。实施例1：重组质粒的构建将EnterococcusfaecalisSK32.001培养至指数生长中期，取2mL菌液10000r/min离心10min弃上清，溶菌酶处理30min后按照试剂盒说明提取基因组DNA。设计如下的引物来用于arcA的扩增：FADI-2：5’-CGCGGATCCATGAGTCATCCAATTAATGT-3’(含BamHI酶切位点），RADI-2：5’-CCGCTCGAGTTAAAGATCTTCACGGT-3’（含XhoⅠ酶切位点），PCR扩增条件：95℃变性3min，30个循环（95℃30s，55℃30s，72℃210s），最后72℃延伸2min。扩增产物纯化后，用BamHI和XhoⅠ对PCR产物和载体pET-28a-c(+)进行双酶切，分别回收酶切产物，用SolutionⅠ连接酶16℃下连接2h，热激转化到DH5α细胞中，待平板长出转化子后，挑取单菌落到LB培养基中，提取质粒，通过酶切验证重组质粒pET-28a-ADI。将质粒转化到BL21(DE3)细胞中，得到BL21(DE3)/pET-28a-ADI工程菌。实施例2：定点突变根据EnterococcusfaecalisSK23.001中编码arcA的编码基因，进行引物设计。G264P-正向引物：5’-CTTGGCTTTTGATATCCCTGAACATCGTAAATTC-3’，G264P-反向引物：5’-GATATCAAAAGCCAAGATATTTTTGAATCCTA-3’，其中下划线部分代表突变体基因编码的264位甘氨酸所对应的密码子。PCR扩增体系为：10×ReactionBuffer5μLdNTPmix1μL正向引物（100ng/μL）1.25μL反向引物（100ng/μL）1.25μL模版pET-28本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定点突变改造的精氨酸脱亚胺酶突变体，称之为基因工程精氨酸脱亚胺酶，其氨基酸序列为SEQ ID No.1。

【技术特征摘要】
1.一种定点突变改造的精氨酸脱亚胺酶突变体，称之为基因工程精氨酸脱亚胺酶，其氨基酸序列为SEQIDNo.1。2.权利要求1所述的定点突变的精氨酸脱亚胺酶突变体的基因DNA，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.一种重组质粒，其特征在于其包含了权利要求2所述的DNA分子。4.一种宿主细胞，其特征在于其含有如权利要求2所述的DNA分子，或含有如权利要求3所述的重组质粒。5.根据权利要求1所述的精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，将含有通过B-FITTER预测获得的氨基酸突变点的精氨酸脱亚胺酶突变质粒转入大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)宿主中，构建突变体，进行序列验证确认，得到最适pH和pH稳定性趋近与生理中性pH7.4的突变体Gly264Pro。6.根据权利要求1所述的精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，江波，蒋航宇，沐万孟，缪铭，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32