本发明专利技术涉及一种(‑)‑γ‑内酰胺酶、其基因及突变体，含有该基因及突变体的重组表达质粒和重组表达转化体，该重组(‑)‑γ‑内酰胺酶的制备，以及该(‑)‑γ‑内酰胺酶在制备(+)‑γ‑内酰胺中的应用。与现有技术相比，本发明专利技术的(‑)‑γ‑内酰胺酶具有酶活性高、底物浓度耐受性好的特点，使用该酶催化制备(+)‑γ‑内酰胺具有反应条件温和、底物浓度高、催化剂用量少等优势，因此在碳环核苷类药物中间体(+)‑γ‑内酰胺的工业生产中具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，尤其是涉及一种(-)-γ-内酰胺酶、其基因及突变体，含有该基因及突变体的重组表达质粒和重组表达转化体，该重组(-)-γ-内酰胺酶的制备，以及该(-)-γ-内酰胺酶在制备(+)-γ-内酰胺中的应用。
技术介绍
γ-内酰胺是化合物2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的简称(亦俗称为文斯内酯)，其分子式为C6H7NO。γ-内酰胺的两个对映异构体都是有用的医药中间体，其中(-)-γ-内酰胺可用于合成抗逆转录病毒药物阿巴卡韦和抗流感病毒药物帕拉米韦；而(+)-γ-内酰胺可用于合成趋化因子受体CCR2拮抗剂MK-0812和二肽基肽酶抑制剂美罗利汀。采用生物催化法制备(+)-γ-内酰胺或(-)-γ-内酰胺，一般采用的是水解酶，目前对(+)-γ-内酰胺酶研究比较广泛，其中许多已被用于(-)-γ-内酰胺的制备。例如：来源于Comamonas acidovorans的(+)-γ-内酰胺酶能有效地催化拆分4.6M(500g L-1)的消旋体γ-内酰胺，剩余的(-)-γ-内酰胺ee值>98％(Bioorg.Med.Chem.,1999,7,2163–2168)。200g L-1纤维素固定化的来源于嗜热菌Sulfolobus solfataricus的(+)-γ-内酰胺酶能有效地催化拆分0.6M(65g L-1)的消旋γ-内酰胺，9h时消旋γ-内酰胺的转化率达到49.5％，剩余(-)-γ-内酰胺的ee值可达到99.5％。将Sulfolobus solfataricus的(+)-γ-内酰胺酶通过大肠杆菌表面展示技术固定在大肠杆菌细胞表面后，40g L-1的重组细胞可以催化0.92M(100g L-1)消旋γ-内酰胺(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2014,98,6991–7001)的水解拆分，4h时转化率达到49.5％，(-)-γ-内酰胺的ee值可达到99.5％。250g L-1(+)-γ-内酰胺固定化酶RutB可催化2.0M(218g L-1)消旋γ-内酰胺的水解拆分，4h转化率可达到50％，(-)-γ-内酰胺的ee值可达到99.5％(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2015,99,4691–4700)。来源于Nocardia farcinica的酰胺酶NfpolyA在纯酶上载量为0.25g L-1时，可催化水解0.46M(50g L-1)的底物(ChemCatChem,2014,6,2517–2521)。10g L-1的Bacillius subtilis168/pMA5-delm冻干细胞可以水解0.92M(100g L-1)消旋γ-内酰胺，22.5h转化率可达到55.2％，(-)-γ-内酰胺的ee值达到99％(Appl.Biochem.Biotechnol.,2015,176,1687–1699)。与(+)-γ-内酰胺酶相比，(-)-γ-内酰胺酶的研究较少，且目前已报道的(-)-γ-内酰胺酶的研究重点主要集中于酶学性质的表征，较少应用于(+)-γ-内酰胺的制备。来源于Bradyrhizobium japonicum USDA 6的(-)-γ-内酰胺酶在0.5mL反应体系中拆分消旋γ-内酰胺，37℃反应24h后，(+)-γ-内酰胺的ee值>99％(中国专利技术专利，公开号CN 103966192A)。30g L-1商业化的Lipolase(CAL-B)在异丙醚-水两相体系中，可以拆分0.2M(22.2g L-1)消旋γ-内酰胺(Eur.J.Org.Chem.,2008,5263–5268；专利技术专利WO 2009/007759A1)。经戊二醛交联的来源于Aureobacterium sp.的(-)-γ-内酰胺酶，在连续化反应中可以拆分0.46M(50g L-1)消旋γ-内酰胺，96h转化率可达到50％，(+)-γ-内酰胺的ee值>99％(Tetrahedron-Asymmetry,1993,4,1117–1128)。这些酶都具有较高的立体选择性，反应转化率达到50％时，剩余的(+)-γ-内酰胺的ee值>99％。尽管如此，由于这些酶活性低，底物浓度耐受性差，因此难以大规模应用。与传统化学合成法相比，生物催化消旋γ-内酰胺水解拆分制备(+)-γ-内酰胺的方法具有反应条件温和、环境友好、操作简单等优点，但是目前(+)-γ-内酰胺的生物催化合成方法仅限于实验室规模，存在酶活性低、催化剂使用量大、产物浓度不高的缺陷，不适合工业化生产。因此，需要筛选活性高、稳定性好且能耐受高浓度产物/产物的酶，以满足工业化生产(+)-γ-内酰胺的需求。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中酶法制备(+)-γ-内酰胺上的不足，提供了一种催化活性高、热稳定性好、对映选择性高以及底物耐受性高的(-)-γ-内酰胺酶SvGL及其突变体，含有该酶及突变体基因的重组表达质粒和重组表达转化体，重组SvGL及其突变体酶粉的制备，以及在制备(+)-γ-内酰胺中的应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：技术方案之一：一种(-)-γ-内酰胺酶，其是如下(a)或(b)的蛋白质：蛋白质(a)：如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列构成的蛋白质；蛋白质(b)：在(a)的氨基酸序列中经过一个或几个氨基酸取代且(-)-γ-内酰胺酶活性提高的衍生蛋白质。所述蛋白质(a)的制备可以是从产绿色链霉菌Streptomyces viridochromogenes CGMCC 4.692中分离获得，或者从重组表达该(-)-γ-内酰胺酶的转化体中分离获得，也可以是人工合成获得。所述产绿色链霉菌Streptomyces viridochromogenes CGMCC 4.692为本实验室从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买，并自行保藏。本专利技术中，专利技术人对实验室保藏的100余株细菌进行培养，培养液离心，取适量静息细胞，悬浮于含有10mM消旋γ-内酰胺的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，振摇反应，检测水解反应底物的转化率，对这些菌株催化水解反应的活性进行评价，其中Streptomyces viridochromogenes CGMCC 4.692表现出最好的反应效果。进而采用鸟枪法对Streptomyces viridochromogenes CGMCC 4.692的(-)-γ-内酰胺酶进行了克隆，获得一个具有高活性的重组(-)-γ-内酰胺酶，命名为SvGL，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。所述蛋白质(b)是在蛋白质(a)的基础上经过一个或几个氨基酸取代而得到的(-)-γ-内酰胺酶活性显著提高的衍生蛋白质。在筛选获得高活性及高立体选择性(-)-γ-内酰胺酶SvGL的基础上，专利技术人对野生型SvGL进行蛋白质改造，以进一步提高该酶的活性。将野生型SvGL在Genebank数据库中进行同源搜索，将获得的序列进行同源比对，对保守位点进行定点饱和突变，发现在SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基础上对第188位的苯丙氨酸进行单点替换后，具有较高的(-)-γ-内酰胺酶活性。此外通过对SvGL的活性口袋和底物通道附近的氨基酸残基进行半理性设计和单点饱和突变，发现本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种(‑)‑γ‑内酰胺酶，其特征在于，其是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)：如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列构成的蛋白质；(b)：在(a)的氨基酸序列中经过一个或几个氨基酸取代且(‑)‑γ‑内酰胺酶活性提高的衍生蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种(-)-γ-内酰胺酶，其特征在于，其是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)：如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列构成的蛋白质；(b)：在(a)的氨基酸序列中经过一个或几个氨基酸取代且(-)-γ-内酰胺酶活性提高的衍生蛋白质。2.根据权利要求1所述的一种(-)-γ-内酰胺酶，其特征在于，所述蛋白质(b)为由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第130位的亮氨酸、第188位的苯丙氨酸经过一个或几个氨基酸取代后形成的新氨基酸序列构成的衍生蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的一种(-)-γ-内酰胺酶，其特征在于，所述蛋白质(b)具有如下序列：(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第188位苯丙氨酸替换为色氨酸；或，(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第188位苯丙氨酸替换为色氨酸，同时第130位亮氨酸替换为异亮氨酸；或，(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第188位苯丙氨酸替换为色氨酸，同时第130位亮氨酸替换为酪氨酸。4.一种分离的核酸，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，殷金岗，郑高伟，潘江，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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