本发明专利技术涉及通过基因工程改造获得的链霉菌酪氨酸酶。本发明专利技术所述的一种定点突变改造的基因工程酪氨酸酶，其特征在于所述定点突变的基因工程链霉菌酪氨酸酶氨基酸序列相对于天然的链霉菌酪氨酸酶氨基酸序列的第7位谷氨酰胺突变为赖氨酸，第234位甘氨酸突变为脯氨酸。本发明专利技术所述的基因工程链霉菌酪氨酸酶最适温度相对于天然的链霉菌酪氨酸酶提高了10℃，在60℃下的半衰期提高了3倍，为其高效合成黑色素奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种热稳定性及最适作用温度提高的酪氨酸酶突变体，属于基因工程
技术背景 酪氨酸酶（Tyrosinase, EC 1. 14. 18. 1)是一种含有双铜离子的金属酶。酪氨酸酶 是多功能酶，在氧气的参与下可以催化单酚生成二元酚（一元酚酶活性）；催化二元酚生成 相应的醌（二元酚酶活性）。而醌在经过一系列酶催化及非酶催化的氧化还原反应后最终 生成黑色素。酪氨酸酶广泛的存在于动植物及微生物中。一般认为人类的毛发、眼睛、皮肤 上的颜色都是由酪氨酸酶决定的，因而大多数化妆品行业通过研宄酪氨酸酶酶抑制剂来开 发美白产品。人体内如果酪氨酸酶代谢异常将会导致一系列疾病的发生，例如白癜风和白 化病等。同时禽类的羽毛，及昆虫甲壳的颜色也酪氨酸酶相关，它的产物黑色素可以与蛋白 交联结合成坚硬的支架，起到保护作用。在植物体内，酪氨酸酶可以催化生成一些对人体有 益的物质，例如茶多酚。此外，水果表面受损时的褐变也与酪氨酸酶相关，食品行业研宄开 发酪氨酸酶抑制剂来保鲜水果。此外，酪氨酸酶在工业上也有重要的应用。首先，酪氨酸 酶可以催化酪氨酸合成左旋多巴等有益的酚类物质，左旋多巴是效果良好的抗颠麻痹药， 已经被广泛的应用于临床。此外，酪氨酸酶还可以用于制备生物传感器，用来检测环境中酚 类化合物的浓度。由于工业污染，导致大量的酚类化合物被排放到自然环境中（主要是水 源），导致严重的污染，而大部分酚类化合物对人体有毒害作用，而酪氨酸酶由于底物的广 谱性，大部分的酚类化合物均可以被酪氨酸酶催化，因此，酪氨酸酶还可以被用来清除污染 环境中的酚类化合物。当然，酪氨酸酶还以用来制备黑色素。 黑色素广泛存在于动植物和微生物中，与生物自我保护机制有关。有研宄表明， 天然的黑素色具有紫外吸收、抗氧化、清除自由基、螯合阳离子（例如有毒的重金属）、新型 的药物载体、作为治疗某些与黑色素缺乏相关的神经系统疾病，例如着色性干皮病、帕金森 氏症、老年性痴呆症、亨廷氏舞蹈病等，有报道指出，可溶性的黑色素在体外具有抗HIV的 活性，为治疗艾滋病开辟了一个新途径。目前黑色素生产主要为动植物提取和采用化学法 以酪氨酸为原料生产，这两种方法成本高、工艺繁琐，使黑色素因价格昂贵而限制其大规模 的生产与应用。微生物所产的黑色素是由其体内的酪氨酸酶催化酪氨酸形成的多巴类黑色 素，是氨基酸的衍生物，具有无毒、无害等特点，而且产黑色素的微生物种类繁多，生产工艺 简单，易于操作，不受时间与地域的限制，因此用微生物来生产黑色素具有巨大的优势。 Streptomyces kathirae SC-I是本实验室前期筛选获得的一株高产黑色素菌株 (保藏编号为：CCTCC M 2012432,专利申请公布号：CN104403975A)，对 S.kathirae SC-I 发 酵产黑色素条件进行了优化，发现该菌株具有极高的黑色素生产潜力，但发现酪氨酸酶的 稳定性较低，导致黑色素发酵后劲不足，严重限制黑色素的产量。因此需要提高酪氨酸酶的 稳定性。 定点突变是提高酶稳定性的重要手段之一。与其他提高酶稳定性的策略相比，定 点突变更迅速，直接并且节约成本。而随着生物信息学的发展，很多预测软件被研宄开发 出来用来辅助定点突变，使定点突变得到正突变的效率明显提高。本专利技术基于已得到的酪 氨酸酶在大肠杆菌中的表达平台，利用以计算机模拟为基础的定点突变技术，对酪氨酸酶 进行分子改造，获得稳定性显著提高的酪氨酸酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，通过对酪氨酸酶进行分子改造，使改造后的酪氨酸酶在稳定 性方面有所提高，最终应用于黑色素的生产。 本专利技术提供了一种定点突变改造的酪氨酸酶突变体，有链霉菌Streptomyces kathirae SC-I酪氨酸酶基因出发，运用定点突变获得，所述的酪氨酸酶突变体的氨基酸序 列为SEQ ID No. 1，该酪氨酸酶突变体是由SEQ ID No. 2的核苷酸系列所编码。 所述发生突变的氨基酸位于酪氨酸酶蛋白结构的表面，所述突变可以增加蛋白表 面的静电相互作用或增加蛋白疏水相互作用。 所述的氨基酸发生突变的是酪氨酸酶第7位谷氨酰胺替换成赖氨酸、第234位甘 氨酸替换成脯氨酸，所得单突变体分别命名为Q7K、G234P。 所述多个氨基酸发生突变包括：第7位谷氨酰胺替换成赖氨酸、第234位甘氨酸替 换成脯氨酸，所得单突变体分别命名为Q7K/G234P。 本专利技术提供一种所述酪氨酸酶突变体的制备方法，具体步奏如下： 1、将SEQ ID No. 2通过PCR的方法，以含有酪氨酸酶基因序列的pET-28aC2为 模板，获得含有pET-28a(+)质粒RBS序列的酪氨酸酶基因，并且克隆至已含有酪氨酸酶 金属伴侣基因序列的质粒pET-28aCl中，使酪氨酸酶金属伴侣及酪氨酸酶各自携带有 pET-28a(+)的RBS序列，构建重组质粒pET-28aClNC2 ; 2、利用Swiss-Model软件对亲本酪氨酸酶进行模拟，获得酪氨酸酶空间结构； 3、设计突变引物，通过反向PCR对酪氨酸酶基因序列进行定点突变，获得含有突 变酪氨酸酶基因序列的重组载体； 4、将突变后的重组载体热激转化大肠杆菌BL21，诱导表达，离心收集菌体，破细胞 后使用Ni-NTA进行蛋白纯化获得酪氨酸酶突变体。 本专利技术提供的酪氨酸酶单突变体或组合突变体热稳定性均显著提高，其中组合突 变体的最适作用温度提高了 l〇°C，在60°C下的半衰期提高了 3倍。相对于采用筛菌或定向 进化等手段，缩短了酶学性质的改造时间。将该酪氨酸酶体变体应用于提高黑色素的产量 及其他相关应用具有广阔的应用前景。 具体实施方法 实施例1酪氨酸酶突变位点的确定 利用Swiss-Model软件对亲本酪氨酸酶进行模拟，获得酪氨酸酶空间结构为基 础，利用POPMuSiC在线服务器计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化（Λ AG) 来辅助设计提高酪氨酸酶的稳定性，选择去折叠自由能变化显著的氨基酸作为突变位当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定点突变改造的基因工程酪氨酸酶，所述的基因工程酪氨酸酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，郭静，杨套伟，徐美娟，张显，满在伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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