志贺氏菌的IC‑LAMP检测引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种志贺氏菌的IC‑LAMP检测引物组及其应用，其中检测引物包括正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3；本发明专利技术将志贺氏菌的IC‑LAMP检测引物组和结合有志贺氏菌特异抗体的Protein A/G偶联磁珠用于志贺氏菌的IC‑LAMP检测试剂盒中，并建立了志贺氏菌环介导等温扩增快速检测方法；该技术整合了抗体和环介导等温扩增技术的双重特异性，具有准确、快速、方便、高效、特异、灵敏且无需进行菌体的长时扩增培养、提取基因及质粒的特点，适用于进出口检疫、食品卫生检验等的现场快速检测，对于保障食品安全具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
志贺氏菌的IC-LAMP检测引物组及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于志贺氏菌检测的引物组、试剂盒和志贺氏菌的IC-LAMP检测方法。
技术介绍
志贺氏菌为革兰阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。志贺菌可穿入低位肠段的粘膜，引起粘液分泌、充血、白细胞浸润、水肿，并常有表浅粘膜溃疡。急性典型菌痢症状，有腹痛腹泻、脓血粘便、里急后重、发热等呈现严重的全身中毒症状。志贺菌属是主要的肠道病原菌之一，也是引起人类细菌性痢疾的病原体。本属细菌分布于全世界，是炎症性痢疾的典型病原菌，很多地区5%~10%的腹泻性疾病是由该菌属所致。弗氏志贺菌和宋内志贺菌比鲍氏志贺菌和毒力特别强的痢疾志贺菌分布更广。志贺菌广泛存在于食品中，大量食入，会引起严重后果。因此，快速准确地检测出志贺氏菌就显得尤为重要。目前临床应用的志贺氏菌的检测方法包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学检测方法等，但这些方法都存在一些缺陷。传统的检测方法主要采用细菌前增菌培养、分离培养、菌落形态观察和一系列的生化鉴定以及血清型鉴定等步骤，一般需4至7天，此方法培养时间长、工作量大、实验步骤繁琐，在很多突发事件中不能及时反映准确的数据。免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低。常规PCR方法检测其灵敏度低，检测时间长，需要昂贵的PCR仪器以及电泳仪、凝胶成像仪等配套仪器并且在检测前还需要进行菌体的富集，DNA的提取。免疫磁分离技术是将特异性抗体与一定大小的磁珠偶联，利用特异性抗体能与细胞表面抗原相结合的原理，将磁球与细胞结合，在外磁场的作用下，将磁球-细胞复合物从环境中分离出来，达到获取目标细胞的一项技术，但是单独使用该技术时只能实现分离，还需结合其他手段进行检测，而目前使用免疫磁分离技术进行分离的检测方法的灵敏度仍有待提高。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供了一种用于检测志贺氏菌的IC-LAMP特异性引物组，它包括正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，各引物序列如下：FIP:5'-CTGTCGAAGCTCCGCAGAGGTTTTGGATTCCGTGAACAGGTCG-3'；（如SEOIDNO：1所示）BIP:5'-CTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCTTTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA-3'；（如SEOIDNO：2所示）F3:5'-ATACCGTCTCTGCACGCA-3'；（如SEOIDNO：3所示）B3:5'-GCCTTCTGATGCCTGATGG-3'；（如SEOIDNO：4所示）。本专利技术另一目的是提供一种志贺氏菌的IC-LAMP检测试剂盒，其包括权利要求1所述的志贺氏菌的IC-LAMP检测引物组和结合有志贺氏菌特异抗体的ProteinA/G偶联磁珠。其中结合有志贺氏菌特异抗体的ProteinA/G亲和磁珠是采用ProteinA/G可以特异性的与抗体Fc段结合的原理制备的，具体参考ProteinA/G免疫沉淀磁珠（美国Biotool，货号：B23202）产品说明书所述方法制得。本专利技术试剂盒还包括常规LAMP检测中所需的常规试剂，例如2×isothermalmastermix、无核酸酶水。本专利技术将环介导等温扩增技术（LAMP)与免疫磁珠相结合，针对志贺氏菌重要的毒性基因ipaH基因设计一套引物，优化反应条件，建立志贺氏菌IC-LAMP检测技术。本专利技术另一目的是提供了一种志贺氏菌检测的新方法，利用ProteinA/G免疫沉淀磁珠与志贺氏菌的多克隆抗体偶联形成免疫磁珠去捕捉样品中的志贺氏菌，然后通过直接裂解法获得基因组，通过环介导等温扩增，确认是否存在有志贺氏菌扩增产物。所述的待测样品可以是被志贺氏菌污染的水、食品及人和动物的粪便及咽拭子/肛拭子等。检测方法具体步骤如下：（1）待测样品的制备，将待测样品用已经灭菌的LB液体培养基进行稀释；（2）在待测样品中添加结合有志贺氏菌特异抗体的ProteinA/G偶联磁珠，混匀后进行磁性分离，弃上清液，然后加入PBS-T溶液重悬后再进行磁性分离，重复2-3次；（3）采用直接裂解法裂解步骤（2）中捕获菌体的基因组DNA，即在步骤（2）获得的磁珠-抗体-抗原的复合物中加入裂解液进行裂解，然后加入终止液终止反应；（4）采用针对志贺氏菌的IC-LAMP检测引物组对获得基因组DNA进行环介导等温扩增，反应体系：15μL2×isothermalmastermix、2μL的10mM正向内引物FIP、2μL的10mM反向内引物BIP、0.25μL的10mM反向外引物B3、0.25μL的10mM正向外引物F3、步骤（3）裂解液模板1-6μL，加无核酸酶水补至终体积25μL；反应条件：65℃扩增30min，80℃-98℃变性10min，终止反应；（5）扩增产物利用紫外检测系统、色素法或荧光法检测（根据不同的显色法加入不同的显色剂），判断是否存在志贺氏菌；检测方法均为常规检测法。例如扩增反应结束后，直接在紫外灯下观察结果（扩增前显色剂即加入扩增的PCR管中）；结果判定：PCR管中样品在紫外照射下出现绿色荧光，检测结果为阳性，则说明样品中含有志贺氏菌；PCR管中样品在紫外照射下不出现绿色荧光，检测结果为阴性，则说明样品中不含有志贺氏菌。实验结果表明：采用本专利技术所公开的志贺氏菌的IC-LAMP特异性引物组制备的试剂盒在检测志贺氏菌方面IC-LAMP具有良好的积极效果。本专利技术公开的用于检测志贺氏菌的试剂盒与现有技术相比所具有的积极效果在于：（1）本专利技术采用的LAMP技术具有操作简便、快速、敏感等特点，其敏感性比常规PCR高数倍以上；而且检测过程只需恒温水浴锅和便携式磁力架即可完成，不需要PCR仪等昂贵的设备（恒温水浴锅即可），更适合于基层推广应用。此外，本专利技术将LAMP技术与免疫磁珠技术相结合，可以通过肉眼直接观察和判定结果，仅需30min，比传统的生化培养法节省3天，比提取基因组进行PCR方法（琼脂糖凝胶电泳）缩短3h，且不需要对菌体进行富集，提取其基因组等，使检测更为便捷、高效；（2）基于IC-LAMP方法的敏感、特异，成本低廉，便于操作等诸多优势，本专利技术在一定程度上提高了我国志贺氏菌菌株的检测能力，为志贺氏菌疾病的临床实时快速诊断、动物和食品的出入境检验检疫中该菌的快速准确检测提供了新技术来源，对提高我国检验检疫机构志贺氏菌的疫情监控和快速检测水平，以及普及先进技术在基层检验检疫机构的推广应用均具有重要意义。特别对于粪便等特殊样品的检测，此方法解决了从粪便等特殊样品中菌体的获取、富集的难题，其灵敏度比利用普通检测方法如PCR、多重荧光定量PCR等方法高。附图说明图1(a)为利用正向外引物F3、反向外引物B3进行PCR鉴定体系的特异性检测结果，泳道2的反应模板为志贺氏菌的基因组；泳道3至泳道7依次为大肠杆菌、金黄色葡萄菌、沙门氏菌、李斯特杆菌、铜绿假单胞杆菌基因组；泳道8为去核酸酶水作为模板的阴性对照；（b）利用正向外引物F3、反向外引物B3进行PCR鉴定体系的灵敏度检测结果，其反应模板为质粒，泳道2-10其质粒浓度依次为109、108、107、106、105、104、103、102、101、100copies/mL，泳道11为去核酸酶水作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种志贺氏菌的IC‑LAMP检测引物组，其特征在于：包括正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，各引物序列如下：正向内引物FIP：FIP:5'‑CTGTCGAAGCTCCGCAGAGGTTTTGGATTCCGTGAACAGGTCG‑3'；反向内引物BIP：BIP:5'‑CTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCTTTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA‑3'；正向外引物F3：F3: 5' ‑ATACCGTCTCTGCACGCA‑3'；反向外引物B3：B3: 5' ‑GCCTTCTGATGCCTGATGG‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种志贺氏菌的IC-LAMP检测引物组，其特征在于：包括正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，各引物序列如下：正向内引物FIP：FIP:5'-CTGTCGAAGCTCCGCAGAGGTTTTGGATTCCGTGAACAGGTCG-3'；反向内引物BIP：BIP:5'-CTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCTTTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA-3'；正向外引物F3：F3:5'-ATACCGTCTCTGCACGCA-3'；反向外引物B3：B3:5'-GCCTTCTGATGCCTGATGG-3'。2.一种志贺氏菌的IC-LAMP检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的志贺氏菌的IC-LAMP检测引物组和结合有志贺氏菌特异抗体的ProteinA/G偶联磁珠。3.根据权利要求2所述的志贺氏菌的IC-LAMP检测试剂盒，其特征在于：IC-LAMP检测试剂盒还包括2×isothermalmastermix、无核酸酶水。4.权利要求2所述志贺氏菌的IC-LAMP检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）待测样品的制备，将待测样品用灭菌的LB液体培养基进行稀释；（2）在待测样品中添加...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金阳，张立定，韦秋奖，宋玉竹，夏雪山，韩芹芹，陈强，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53