一种利用ISSR反应体系分析草果遗传多样性的方法技术

本发明专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，本发明专利技术公开了一种利用ISSR反应体系分析草果遗传多样性的方法，其中，ISSR反应体系如下：每25μL的反应体系中含有不含Mg

【技术实现步骤摘要】
一种利用ISSR反应体系分析草果遗传多样性的方法
本专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体地说，涉及一种利用ISSR反应体系分析草果遗传多样性的方法。
技术介绍
草果(AmomumtsaokoCrevostetLemaire)是姜科豆蔻属植物中一种多年生草本植物，不仅是我国食品加工业和轻工业的重要原料，而且是一种传统的中药材，有燥湿、健胃、祛痰、温中、顺气、抗疟等功能，还是大众的调料食品，国际、国内市场需求量大。草果对生长环境条件要求较高，一般生长在海拔800～1500m的北热带和中、南亚热带中低山区，年降雨量在1200～1600mm，年平均气温在16～22℃，冬季多雾、湿度大、透光度在40％～50％的阴湿山坡沟谷森林环境下，主要分布在我国云南、广西和贵州三省局部地区，其中云南是草果主产区，产量约占全国的95％，主要分布在红河、文山、西双版纳、德宏、保山、思茅、临沧7个地(州)的31个县(市)。分子标记是一种以DNA序列差异性为标记的检测遗传多样性的方法，具有不受外界环境及基因表达与否的影响，不影响实验材料的性状、可标记数量大及分辨率高等特点，目前被广泛应用于生物遗传研究。ISSR(简单序列重复区间扩增多态性，Intersimplesequencerepeat)分子标记技术是Zietkeiwitcz等(ZietkiewiczE,RafalskiA,LabudaD(1994)Genomefingerprintingbysimplesequencerepeat(ISSR)-anchoredpolymerasechainreactionamplification.Genomics20:176–183)于1994年发展起来的一种基于微卫星序列的分子标记。以其简便迅速、多态性高、重复性好等优点被广泛应用于动植物的品种鉴定、DNA指纹图谱构建和种质资源多样性研究等领域，同时在中草药种内和种间鉴定等方面得到广泛运用。目前在姜科植物砂仁中有过利用ISSR标记分析不同产地砂仁遗传多样性的报道，但在草果中，应用ISSR分子标记技术进行种质资源鉴定、遗传多样性分析的方法尚未见报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种利用ISSR反应体系分析草果遗传多样性的方法，该方法是一种简单、易于操作的分子标记技术，可为草果资源鉴定、遗传多样性分析等科学研究提供很好的技术指导和理论支持。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种用于草果遗传多样性分析的ISSR分子标记引物体系，所述引物序列包括：UBC807：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；UBC809：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；UBC835：其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；UBC836：其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；UBC841：其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；UBC842：其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；UBC847：其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；UBC862：其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；UBC873：其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；UBC885：其核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；UBC888：其核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。本专利技术还公开了一种用于草果遗传多样性分析的ISSR-PCR反应体系，每25μL的反应体系中含有不含Mg2+的10×PCRbuffer3.0μL、Taq酶1.5U、Mg2+1.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L、引物0.3μmol/L和模板DNA50ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性1min，50-58℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。进一步地，所述引物选自上述SEQIDNO.1～11中的任一条。进一步地，所述退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下：SEQIDNo.150℃SEQIDNo.252℃SEQIDNo.353℃SEQIDNo.453℃SEQIDNo.554℃SEQIDNo.654℃SEQIDNo.753℃SEQIDNo.858℃SEQIDNo.954℃SEQIDNo.1053℃SEQIDNo.1152℃。本专利技术还公开了一种利用ISSR反应体系分析草果遗传多样性的方法，其步骤包括：(1)DNA的提取：采集嫩叶用于全基因组DNA提取；(2)采用ISSR-PCR反应体系对步骤(1)中提取的DNA样品进行扩增；(3)将PCR扩增产物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳结束后银染检测条带；(4)利用ISSR分子标记引物体系将不同来源的草果进行聚类及主坐标分析；(5)遗传多样性分析：计算草果实验材料遗传多样性参数。进一步地，步骤(1)中的DNA的提取具体为：采用2*CTAB法提取DNA，并将提取的DNA样品溶于TE缓冲液后存储于-20℃备用，扩增前用双蒸水将DNA样品稀释成20ng/μl的工作液，作为PCR扩增反应的模板。进一步地，步骤(2)中ISSR-PCR反应体系具体为：每25μL的反应体系中含有不含Mg2+的10×PCRbuffer3.0μL、Taq酶1.5U、Mg2+1.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L、引物0.3μmol/L和模板DNA50ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性1min，50-58℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。进一步地，步骤(3)中将PCR扩增产物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳进行分离，电泳结束后银染检测条带。具体为：电泳结束后，将胶体从玻璃板上取下，蒸馏水漂洗，转入含有0.2％硝酸银的染色液中，振荡10min，蒸馏水漂洗1次约1min，转入含2％氢氧化钠和0.4％甲醛的显色液中，轻轻振荡待条带显色完全，将胶体转入蒸馏水中；在凝胶成像系统下对胶体进行拍照保存。进一步地，步骤(4)中聚类分析和主坐标分析具体为：读取步骤(3)获得的谱带信息，将电泳图谱上100～2000bp范围内清晰且重复出现的条带记为1，同一位置没有条带记为0，由此生成0和1原始矩阵；统计每条引物扩增出的总条带数和多态性条带数；用NTSYS-pc(2.10e)软件中SimQual程序计算相似系数矩阵，以Clustering程序中SHAN进行UPGMA聚类；用Treeplot模块生成聚类图，构建分子进化树；根据计算的相似系数矩阵进行Decenter数据转换，进而进行主坐标分析。进一步地，步骤(5)中遗传多样性分析具体为：根据01二元数据矩阵，统计ISSR扩增产物的条带总数和多态性条带数(NPB)，计算多态性条带所占的比率(PPB)和引物多态性信息含量(PIC)，PICi＝2fi(1－fi)，公式中PICi表示第i个位点的多态性信息含量，fi表示有带所占的频率，(1－fi)表示无带所占的频率；对每条引物来说，PIC＝∑PICi/n，式中n表示每条引物的多态性条带数；对每条引物而言，标记指数(MI)按下述公式计算：MI＝NPB*PIC；釆用POPGene32软件对所有试验材料进行遗传多样性参数计算：等位基因数、有效等位基因数、Shannon's信息本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于草果遗传多样性分析的ISSR分子标记引物体系，其特征在于，所述引物序列包括：UBC807：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；UBC809：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；UBC835：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；UBC836：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；UBC841：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；UBC842：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；UBC847：其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；UBC862：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；UBC873：其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；UBC885：其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；UBC888：其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于草果遗传多样性分析的ISSR分子标记引物体系，其特征在于，所述引物序列包括：UBC807：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；UBC809：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；UBC835：其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；UBC836：其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；UBC841：其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；UBC842：其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；UBC847：其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；UBC862：其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；UBC873：其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；UBC885：其核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；UBC888：其核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。2.一种用于草果遗传多样性分析的ISSR-PCR反应体系，其特征在于，每25μL的反应体系中含有不含Mg2+的10×PCRbuffer3.0μL、Taq酶1.5U、Mg2+1.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L、引物0.3μmol/L和模板DNA50ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性1min，50-58℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。3.根据权利要求2所述的用于草果遗传多样性分析的ISSR-PCR反应体系，其特征在于，所述引物选自权利要求1中的所述SEQIDNO.1～11中的任一条。4.根据权利要求2所述的用于草果遗传多样性分析的ISSR-PCR反应体系，其特征在于，所述退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下：5.一种利用ISSR反应体系分析草果遗传多样性的方法，其特征在于，其步骤包括：(1)DNA的提取：采集嫩叶用于全基因组DNA提取；(2)采用ISSR-PCR反应体系对步骤(1)中提取的DNA样品进行扩增；(3)将PCR扩增产物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳结束后银染检测条带；(4)利用ISSR分子标记引物体系将不同来源的草果进行聚类及主坐标分析；(5)遗传多样性分析：计算草果实验材料遗传多样性参数。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的DNA的提取具体为：采用2*CTAB法提取DNA，并将提取的DNA样品溶于TE缓冲液后存储于-20℃备用，扩增前用双蒸水将DNA样品稀释成20ng/μl的工作液，作为PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢丙越，马孟莉，雷恩，王田涛，孟衡玲，袁盛勇，刘艳红，苏一兰，李春燕，张薇，张虹，
申请(专利权)人：红河学院，
类型：发明
国别省市：云南,53