一种从蛹虫草子实体上快速分离培养单孢的方法技术

本发明专利技术涉及一种从蛹虫草子实体上快速分离培养单孢的方法。该方法包括取距蛹虫草子实体顶部1/2～1/3区域内部位，分割后取一段粘贴在干燥密封盖上，倒悬在灭菌水上方，闭盖培养，获得孢子悬浮液；吸取孢子悬浮液转移至平板培养基上，涂抹均匀后黑暗倒置培养12小时以上；寻找挑取单个萌发的孢子，转移至灭菌培养管中，于18～22℃条件下闭盖培养；获得单孢培养物。该方法实用性强，便于操作。本发明专利技术可简单快捷的对蛹虫草子实体的孢子进行分离及培养，简化实验操作，提高培养成功率。分离培养物可进行单细胞杂交试验、遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传图谱的构建和功能基因的研究；相较传统方法，可以大大缩短分析周期，提高效率。

Method for rapidly separating and culturing single spore from Cordyceps militaris fruiting body

The invention relates to a method for rapid isolation and cultivation of single spore from Cordyceps militaris fruiting body. The method comprises the following steps taken from Cordyceps militaris on top of 1/2 ~ 1/3 region location, segmentation for a paste in the dry seal cover, hangs upside down in the sterile water above the closing cover training, get the spore suspension; from spore suspension transferred to the plate medium, evenly after dark inverted 12 hours of training looking above; from single spores germination, transferred to sterilized culture tube, from 18 to 22 DEG C under the condition of close cover cultivation; obtain single spore culture. The method is practical and easy to operate. The invention can be used for separating and culturing the spores of the Cordyceps militaris fruiting body, simplifying the experimental operation and improving the success rate of culture. The separation of culture can be a single cell hybridization, genetic diversity analysis, germplasm identification, genetic mapping and gene function research; compared with the traditional method, can greatly shorten the cycle, improve efficiency.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物科学领域，特别涉及一种从蛹虫草子实体上快速分离培养单孢的方法。
技术介绍
蛹虫草Cordycepsmilitaris作为一种虫生真菌具有多种药用功效，在医疗保健领域具有广阔的应用前景。尽管在人工培养、菌种选育、分子生物学、活性成分等方面已经对蛹虫草做了大量研究工作，但菌种退化在人工栽培方面还存在明显的技术难题。在蛹虫草培养研究中，优良菌种的选育和高产培养条件的研究仍是蛹虫草研究的重点。有研究表明，蛹虫草菌多孢菌株(包括多子囊孢子菌株和多分生孢子菌株)或组织分离来源的菌株在相同条件下产子实体的能力经常发生变化；多孢菌株或组织分离菌株比单孢菌株更容易发生菌种退化。现有的蛹虫草菌种选育时，获取孢子后，一般通过平板划线和涂布的方法，以将孢子稀释到合适的程度，待菌落形成后，作进一步的挑选。这种选育方法虽然操作简单，但是由于技术本身的限制，难以获得单孢生长形成的菌落，获得的菌落需要进行进一步的分离和挑选。这一方法需要进行大量的重复性劳动，分离效率低，选育耗时长，难以满足生产的需要。因此通过技术创新，快速分离培养获得大量单孢菌株，对蛹虫草的栽培具有重要的理论和实践意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种从蛹虫草子实体上快速分离培养单孢的方法。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种从蛹虫草子实体上快速分离培养单孢的方法，包括步骤如下：(1)向带有密封盖的培养管加水、灭菌，得灭菌水，干燥密封盖，备用；(2)取距蛹虫草子实体顶部1/2～1/3区域内部位，分割成数段，每段虫草子实体的长度小于密封盖的内径；(3)取其中一段虫草子实体，粘贴在干燥密封盖上，倒悬在灭菌水上方，闭盖，于20～25℃条件下培养24～48h，待虫草子实体上的孢子弹落灭菌水中形成孢子悬浮液；(4)将PDA培养基倒入培养皿中，制得平板培养基，吸取孢子悬浮液转移至平板培养基上，涂抹均匀，置于温度20～25℃下黑暗倒置培养12小时以上；(5)另外取PDA培养基装入干净的培养管中，灭菌后备用；(6)将步骤(4)的培养皿置于体式镜下，观察寻找单个萌发的孢子，挑取萌发的孢子，转移至步骤(5)中的培养管中，于18～22℃条件下闭盖培养；获得单孢培养物。本专利技术优选的，步骤(1)、步骤(5)的培养管为带盖的离心管，离心管规格为1.5ml或2ml，灭菌水为1ml。本专利技术优选的，步骤(1)、步骤(5)中灭菌温度为120～125℃，灭菌时间10～30min，优选的，灭菌温度为121℃，灭菌时间20min。本专利技术优选的，步骤(2)取距蛹虫草子实体顶部2/5～1/3区域内部位进行分割，最为优选的，取距蛹虫草子实体顶部1/3区域内部位进行分割。本专利技术优选的，步骤(2)每段虫草子实体的长度为5～7mm。本专利技术优选的，步骤(3)中的粘贴方式为通过凡士林将虫草子实体粘贴在密封盖上，优选的，将凡士林涂抹于虫草的端部，然将其倒挂在密封盖上。本专利技术优选的，步骤(3)虫草子实体粘贴在干燥密封盖的内侧中央位置。本专利技术优选的，步骤(4)中的PDA培养基加入氯霉素或土霉素，加入量为0.1～0.3g/L，优选的，加入量为0.2g/L。抑制细菌的生长，减少干扰。本专利技术优选的，步骤(4)中每1cm2培养基上涂抹0.1～0.3μl孢子悬浮液。本专利技术优选的，步骤(4)中直径为8cm的培养皿加入10μl孢子悬浮液，用涂棒涂抹均匀。本专利技术优选的，步骤(4)黑暗倒置培养温度为22～24℃，培养时间为18～24h。本专利技术优选的，为进一步检验该方法所获得的单孢培养物的可信度，该方法还包括，对步骤(6)获得的单孢培养物进行扩繁后提取DNA，然后进行MAT基因检测，若只扩增出一种交配基因的片段，该培养物为单孢培养物，否则不是单孢培养物。MAT基因检测具体步骤及核苷酸序列参见“交配型基因作为分子标记鉴定蛹虫草退化菌株的核相初步研究”，汪虹，魏静等，食用菌学报@2010.17(4)：1～4，正文第2页。上述扩繁按本领域的常规技术进行。本专利技术的孢子悬浮液转移、单个萌发的孢子的转移使用灭菌的移液枪及10μl枪头进行。本专利技术具有如下优点：1、本专利技术用离心管倒悬虫草子实体获得孢子悬浮液，代替传统的三角瓶或培养皿，小巧灵活，方便操作。2、本专利技术用移液枪插取10μl枪头从平板培养基上挑取单胞，相对于传统的反复火烧接种针灭菌，更换枪头快速，操作简易。3、本专利技术用离心管装PDA培养基，对挑取的单胞进行培养，代替传统的培养皿培养，操作简单，污染少。4、用交配基因对培养物进行检测，以确认所得培养物为单孢培养物，为后续研究所用实验材料的准确性提供依据。5、本专利技术可以快速的从蛹虫草菌子实体上分离得到单个子囊孢子，并对其培养获得单孢培养物。附图说明图1为培养后的单孢培养物的MAT基因扩增结果；图2.为采用琼脂收集与孢子悬浮液涂抹在培养基上获得的单胞的对比图；其中a图为用琼脂收集的孢子，落点比较集中，难以挑取单胞；b图为将孢子悬浮液涂抹在培养基上获得的单胞比较分散，易于挑取单胞。图3a为蛹虫草子座的长度示意图；图3b为采用不同径段的蛹虫草子实体悬挂获得孢子悬浮液后涂抹培养基得到的单胞培养物对比图；其中，培养皿从左往右，分别用蛹虫草0～1cm，1～2cm，2～3cm径段悬挂获得孢子悬浮液后涂抹培养基得到的单胞培养物。0～1cm径段内的单胞培养物最多，1～2cm和2～3cm径段内未得到单胞培养物；具体实施方式本专利技术实施例公开了一种从蛹虫草子实体上进行单孢快速分离培养的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本专利技术所述方法进行改动或者适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术提供的一种从蛹虫草子实体上进行单孢快速分离培养的方法进行详细说明。本专利技术所有操作均需在无菌环境下操作。实施例1(1)准备1.5ml离心管，管内加1ml蒸馏水，在121℃灭菌20min后备用。使用前，高速离心，将离心管盖内壁上的水甩干。(2)将距蛹虫草子实体顶部三分之一区域内具有产孢功能的部位切割成数小段，每小段的长度为6mm，以不超过离心管内盖直径为宜。(3)用镊子夹取一小段虫草子实体，涂抹一点凡士林，粘贴在离心管盖内侧，倒悬在灭菌水上方，闭盖在24℃条件下培养36h，等待虫草子实体上的孢子弹落水中形成孢子悬浮液。(4)准备PDA培养基(200g土豆，20g葡萄糖，18g琼脂粉，1000ml水)，121℃灭菌20min，倒入直径为8cm的培养皿中备用，培养基也可以加入氯霉素或土霉素，加入量为0.2g/L，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰。(5)用灭菌后的移液枪及枪头吸取10μl孢子悬浮液转移至平板培养基上，用涂棒涂抹均匀，23℃黑暗倒置培养20h。(6)用离心管装100μl的PDA培养基，灭菌后备用。(7)将步骤5中的培养皿置于体式镜下，观察寻找单个萌发的孢子，挑取24个单胞，用灭菌的移液枪插取10μl枪头挑取萌发的孢子，将挑取物转移至步骤6中的离心管中，在20℃条件下闭盖培养。并最终获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从蛹虫草子实体上快速分离培养单孢的方法，包括步骤如下：(1)向带有密封盖的培养管加水、灭菌，得灭菌水，干燥密封盖，备用；(2)取距蛹虫草子实体顶部1/2～1/3区域内部位，分割成数段，每段虫草子实体的长度小于密封盖的内径；(3)取其中一段虫草子实体，粘贴在干燥密封盖上，倒悬在灭菌水上方，闭盖，于20～25℃条件下培养24～48h，待虫草子实体上的孢子弹落灭菌水中形成孢子悬浮液；(4)将PDA培养基倒入培养皿中，制得平板培养基，吸取孢子悬浮液转移至平板培养基上，涂抹均匀，置于温度20～25℃下黑暗倒置培养12小时以上；(5)另外取PDA培养基装入干净的培养管中，灭菌后备用；(6)将步骤(4)的培养皿置于体式镜下，观察寻找单个萌发的孢子，挑取萌发的孢子，转移至步骤(5)中的培养管中，于18～22℃条件下闭盖培养；获得单孢培养物。

【技术特征摘要】
1.一种从蛹虫草子实体上快速分离培养单孢的方法，包括步骤如下：(1)向带有密封盖的培养管加水、灭菌，得灭菌水，干燥密封盖，备用；(2)取距蛹虫草子实体顶部1/2～1/3区域内部位，分割成数段，每段虫草子实体的长度小于密封盖的内径；(3)取其中一段虫草子实体，粘贴在干燥密封盖上，倒悬在灭菌水上方，闭盖，于20～25℃条件下培养24～48h，待虫草子实体上的孢子弹落灭菌水中形成孢子悬浮液；(4)将PDA培养基倒入培养皿中，制得平板培养基，吸取孢子悬浮液转移至平板培养基上，涂抹均匀，置于温度20～25℃下黑暗倒置培养12小时以上；(5)另外取PDA培养基装入干净的培养管中，灭菌后备用；(6)将步骤(4)的培养皿置于体式镜下，观察寻找单个萌发的孢子，挑取萌发的孢子，转移至步骤(5)中的培养管中，于18～22℃条件下闭盖培养；获得单孢培养物。2.根据权利要求1所述的从蛹虫草子实体上快速分离培养单孢的方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(5)的培养管为带盖的离心管，离心管规格为1.5ml或2ml，灭菌水为1ml；步骤(1)、步骤(5)中灭菌温度为120～125℃，灭菌时间10～30min，优选的，灭菌温度为121℃，灭菌时间20min。3.根据权利要求1所述的从蛹虫草子实体上快速分离培养单孢的方法，其特征在于，步骤(2)取距蛹虫草子实体顶部2/5～1/3区域内部位进行分割，最为优选的，取距蛹虫草子实体顶部1/3区域内部位进行分割。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔鹏，田伟，李化秀，施新琴，顾寅钰，
申请(专利权)人：山东省蚕业研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37