筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。有益效果为：本发明专利技术可快速得到大量的经微卫星引物标记的紫背浮萍的DNA序列，微卫星标记检测速度快，可快速获得紫背浮萍Sp25和Sp30遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱。紫背浮萍的叶长与 Sp30、叶宽与 Sp25 位点显著相关（P 均小于 0.05），Sp25位点基因型为 CE 的紫背浮萍叶片形态最大，且数量最多。

【技术实现步骤摘要】
筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法
本专利技术涉及DNA分子标记
，具体是一种筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法。
技术介绍
富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来广泛应用的DNA标记，常应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。在自然环境中，紫背浮萍基本以无性生殖进行繁殖，当环境条件适宜时2天即可克隆出一代，种群遗传多样性水平较低。现有技术提供多种卫星标记的检测方法，例如，中国专利技术授权专利文献一种锈斑蟳微卫星标记的快速检测方法授权公告号CN103305611B该专利技术涉及一种锈斑蟳微卫星标记的快速检测方法，包括：（1）锈斑蟳基因组DNA的提取；（2）根据GeneBank数据库中锈斑蟳的功能基因序列，获得含有微卫星重复的基因序列；（3）微卫星标记引物的设计；（4）锈斑蟳不同个体的基因组DNA的PCR扩增；（5）PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。该专利技术的检测方法具有快速、准确、灵敏等优点，能够直观地检测出锈斑蟳不同个体的基因型，从而快速获得锈斑蟳在功能基因微卫星位点遗传变异的多态性图谱，该微卫星标记可应用于锈斑蟳遗传变异与种群遗传多样性分析等领域，但微卫星标记检测速度还有提升空间。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记方法，清晰紫背浮萍的叶数/株、叶长和叶宽与相关DNA位点的关系。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。作为优选，植株克隆体培养的营养液成份及其浓度为：氮0.3~0.4g/L、磷酐0.1~0.15g/L、氧化钾0.16~0.23g/L、氧化镁0.01~0.015g/L和硫0.012~0.02g/L。上述营养液能全面提供紫背浮萍生长所需的大量元素和微量元素，无性繁殖速度快，基因突变的概率低，可得到大量基因相同的植株，样本量足。作为优选，植株克隆体在光照培养箱中进行室内培养50~70d，培养条件为22.5~23.5℃，湿度73~83%，光照强度为1800~2200lux，光暗时间14~16:10~8h。上述培养条件下，紫背浮萍的光合作用强，生长速度快。作为优选，微卫星引物为：Sp25:F:GGCAGAGACAGAAAGATCATC；R:CCTAGTTCCCTAGAGCGAGAG；Sp30：F:CGCCTATAAGTAACCCCCTAC；R:ATCATATCTGCTCGAACCATC。作为优选，PCR扩增体系为18~22ul，其中包括3.4~4.2UTaqDNA聚合酶（Sangon）、1.6~2.2ul10×PCRbuffer、0.7~0.9mMdNTP、上游、下游引物各0.3mM、50~100ngDNA模板，ddH2O补至终体积20ul；在Bio-RadPCR扩增仪上进行扩增，扩增程序为92~96℃预变性4.5~5.6min；93~96℃变性28~33s，52~56℃复性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38个循环；最终70~75℃延伸2.5~3.4min。上述PCR扩增可快速得到大量的经微卫星引物标记的紫背浮萍的DNA序列。作为优选，数据统计与分析为对浮萍克隆的叶数/株、叶长和叶宽进行统计描述，应用单因素方差分析和最小显著差数法或DunnettT3非参数多重比较两两基因型生长性状特征之间的差异性；应用一般线性模型过程对叶数/株、叶长和叶宽性状与微卫星位点的关联性进行最小二乘分析,并对同一位点的各基因型进行多重比较。紫背浮萍的叶长与Sp30、叶宽与Sp25位点显著相关（P均小于0.05），Sp25位点基因型为CE的紫背浮萍叶片形态最大，且数量最多。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术可快速得到大量的经微卫星引物标记的紫背浮萍的DNA序列，微卫星标记检测速度快，可快速获得紫背浮萍Sp25和Sp30遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱。紫背浮萍的叶长与Sp30、叶宽与Sp25位点显著相关（P均小于0.05），Sp25位点基因型为CE的紫背浮萍叶片形态最大，且数量最多。了解基因型差异对紫萍生长以及污染物净化能力的影响，提高废水的生物治理效率。具体实施例下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。植株克隆体培养的营养液成份及其浓度为：氮0.3~0.4g/L、磷酐0.1~0.15g/L、氧化钾0.16~0.23g/L、氧化镁0.01~0.015g/L和硫0.012~0.02g/L。上述营养液能全面提供紫背浮萍生长所需的大量元素和微量元素，无性繁殖速度快，基因突变的概率低，可得到大量基因相同的植株，样本量足。植株克隆体在光照培养箱中进行室内培养50~70d，培养条件为22.5~23.5℃，湿度73~83%，光照强度为1800~2200lux，光暗时间14~16:10~8h。上述培养条件下，紫背浮萍的光合作用强，生长速度快。微卫星引物为：Sp25:F:GGCAGAGACAGAAAGATCATC；R:CCTAGTTCCCTAGAGCGAGAG；Sp30：F:CGCCTATAAGTAACCCCCTAC；R:ATCATATCTGCTCGAACCATC。PCR扩增体系为18~22ul，其中包括3.4~4.2UTaqDNA聚合酶（Sangon）、1.6~2.2ul10×PCRbuffer、0.7~0.9mMdNTP、上游、下游引物各0.3mM、50~100ngDNA模板，ddH2O补至终体积20ul；在Bio-RadPCR扩增仪上进行扩增，扩增程序为92~96℃预变性4.5~5.6min；93~96℃变性28~33s，52~56℃复性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38个循环；最终70~75℃延伸2.5~3.4min。上述PCR扩增可快速得到大量的经微卫星引物标记的紫背浮萍的DNA序列。数据统计与分析为对浮萍克隆的叶数/株、叶长和叶宽进行统计描述，应用单因素方差分析和最小显著差数法或DunnettT3非参数多重比较两两基因型生长性状特征之间的差异性；应用一般线性模型过程对叶数/株、叶长和叶宽性状与微卫星位点的关联性进行最小二乘分析,并对同一位点的各基因型进行多重比较。紫背浮萍的叶长与Sp30、叶宽与Sp25位点显著相关（P均小于0.05），Sp25位点基因型为CE的紫背浮萍叶片形态最大，且数量最多。实施例2：筛选紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。植株克隆体培养的营养液成份及其浓度为：氮0.32g/L、磷酐0.12g/L、氧化钾0.19g/L、氧化镁0.012g/L和硫0.016g/L。上述营养液能全面提供紫背浮萍生长所需的大量元素和微量元素，无性繁殖速度快，基因突变的概率低，可得到大量基因相同的植株，样本量足。植株克隆体在光照培养箱中进行室内培养60d，培养条件为23℃，湿度本文档来自技高网...

【技术保护点】
筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的方法包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。

【技术特征摘要】
1.筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的方法包括克隆体培养、基因组DNA提取、设计微卫星引物、PCR扩增和数据统计与分析。2.根据权利要求1所述的筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的植株克隆体培养的营养液成份及其浓度为：氮0.3~0.4g/L、磷酐0.1~0.15g/L、氧化钾0.16~0.23g/L、氧化镁0.01~0.015g/L和硫0.012~0.02g/L。3.根据权利要求1所述的筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的植株克隆体在光照培养箱中进行室内培养50~70d，培养条件为22.5~23.5℃，湿度73~83%，光照强度为1800~2200lux，光暗时间14~16:10~8h。4.根据权利要求1所述的筛选与紫背浮萍叶生长相关的分子标记的方法，其特征在于：所述的微卫星引物为：Sp25:F:GGCAGAGACAGAAAGATCATC；R:CCTAGTTCCCTAGAGCGAGAG；Sp30：F:CGCCTATAAGTAACCCCCTAC；R:ATCATATCTGCTCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐娜娜，徐嘉俊，朱旭辉，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33