一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一组快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的引物组以及分子鉴定方法。所述引物组序列分别如SEQ ID NO.1～2所示。本发明专利技术在完成对广东株白僵菌线粒体全基因组序列的高通量测序和多个虫草科物种的线粒体全基因组生物信息学比较分析的基础上，比较白僵菌线粒体基因序列在地理种属上的差异，发现白僵菌的核糖体蛋白基因

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法
本专利技术属于物种鉴定及中药材真伪鉴别
更具体地，涉及一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法。
技术介绍
白僵蚕(Bombyxmori)，蚕蛾科昆虫家蚕(BombyxmoriLinnaeus)4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体(国家药典委员会，2015)。白僵蚕中的白僵菌是一类寄生于昆虫的病原真菌，据NCBI最新数据报道，将白僵菌归类于：双核亚界(Dikarya)、子囊菌门(Ascomycota)、盘菌亚门(Pezizomycotina)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌亚纲(Hypocreonycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草菌科(Cordycipitaceae)、虫草属(Cordceps)。白僵蚕作为我国传统的中药材，具有降血糖、降血脂、抗癌、抗惊厥、抗凝、抑菌、镇静催眠、美白等多种药理作用，从而使得其在临床治疗上具有重要的作用。目前农户养殖僵蚕所带来的收益是很可观的，可以作为农民致富的好途径(张伟基，2016)。然而，由于僵蚕具有重要的药理作用和良好的经济效益，使得一些商家为了获得更多利益，开始用假冒和不合格僵蚕充当合格僵蚕。目前传统的伪品僵蚕大多为用石灰水将死家蚕掺白加工而成(赵启有，1998)，也有将地蚕冒充正品僵蚕使用(胡大泽等，2003)，近年来，出现了新的伪品黑死蚕和空心僵蚕。由于伪品僵蚕的外观、显微等均与正品相似，难以应用常规方法进行有效鉴别，为了杜绝该类现象的出现，其真伪鉴别在白僵蚕质量评定工作上显得尤为重要。目前现行的僵蚕质量鉴定方法主要包括两种，一是物理鉴定方法，包括外观鉴别和显微观察(徐国均等，1996；国家药典委员会，2015)、微量升华法(黄晓雪，2005)、SDS-PAGE(邱乙，2014)、灰色关联度分析法(李峰，2011)、紫外指纹图谱(冀宪领，2006)、红外指纹图谱(冀宪领，2007)、高效液相色谱法(王更先，2006)等方法对僵蚕药材质量进行鉴定；二是分子鉴定方法，主要是贾静(2016)等基于COI序列和ITS序列分别对僵蚕药材的基原物种家蚕和白僵菌进行鉴定，从而对白僵蚕的质量及品质进行鉴定。其中，分子鉴定具有更准确、操作简便等特点，应用前景更好。目前对僵蚕中白僵菌真伪鉴定方面，一直缺少特异验证白僵菌的引物，缺乏一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有僵蚕真伪鉴定技术的缺陷和不足，完成对广东株白僵菌线粒体全基因组序列的高通量测序，比较白僵菌线粒体基因序列在地理种属上的差异，发现白僵菌的核糖体蛋白基因rps3变异明显；并基于白僵菌线粒体rps3基因序列设计引物，寻找特异扩增真菌白僵菌的引物，提供一种特异鉴定白僵菌的分子标记方法，从而快速鉴别僵蚕中白僵菌的真伪，为中药材僵蚕临床用药安全工作上提供分子技术支持。本专利技术的目的是提供白僵菌的核糖体蛋白基因rps3序列。本专利技术另一目的是提供一组鉴定验证僵蚕中白僵菌真伪的引物组。本专利技术再一目的是提供一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法。本专利技术的再一目的是提供一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的试剂盒。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术人在完成对广东株白僵菌线粒体全基因组测序和13个虫草科物种的线粒体全基因组生物信息学比较分析的基础上，发现白僵菌的核糖体蛋白基因rps3变异明显，并基于广东株白僵菌线粒体的rps3基因序列设计筛选得到了1对能特异检测白僵菌的引物。一组鉴定验证僵蚕中白僵菌真伪的引物组，为引物对F935和R1385，序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述引物组在鉴定验证僵蚕中白僵菌真伪中的应用，在构建快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法中的应用，以及在制备快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的试剂盒中的应用，均应在本专利技术的保护范围之内。一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法，以待测中药材白僵蚕总DNA为模板，利用引物组F935/R1385进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR扩增结果有无清晰的500bp目的电泳条带来判断待测中药材白僵蚕样品中是否含有白僵菌。进一步优选地，还可继续对PCR扩增产物进行测序及数据对比，构建系统进化树，进一步确定结果。其中，优选地，所述白僵蚕总DNA的提取方法为：先将白僵蚕预处理成粉末后，进行总DNA提取；所述预处理是指：用65～75％乙醇擦拭白僵蚕表面后，放于30～40℃环境中使酒精挥发，再粉碎磨粉。具体更优选地，所述白僵蚕总DNA的提取方法为：先用70％乙醇擦拭白僵蚕表面后，放于37℃环境中使酒精挥发，再用高速多功能粉碎机磨粉；然后加入液氮充分研磨，使用真菌基因组快速提取试剂盒抽提总DNA，置于-20℃保存备用。另外，优选地，所述PCR的反应体系为：2xTaqMasterMix25μl，10pmol/μL的上下游引物各1μl，DNA模板1μl，ddH2O2μl。优选地，所述PCR的反应条件：94℃5min；94℃30s，44℃30s，72℃45s，25个循环；72℃10min。一种包含有上述的引物对F935和R1385的快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的试剂盒，也在本专利技术的保护范围之内。优选地，所述试剂盒还可以包含有以待测中药材白僵蚕总DNA为模板，利用引物组F935/R1385进行PCR扩增所需的试剂。该试剂盒的使用方法如上所述快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法。本专利技术在完成对广东株白僵菌线粒体全基因组测序和13个虫草科物种的线粒体全基因组生物信息学比较分析的基础上，发现白僵菌的核糖体蛋白基因rps3变异明显，并基于广东株白僵菌线粒体全基因序列设计合成引物，最终筛选出了1对能特异检测白僵菌的引物。并利用12株地理株系白僵菌以及市售僵蚕样品进行引物有效性验证，完成了对设计引物特异性、有效性的验证，建立了高效、快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术基于对广东株白僵菌线粒体全基因组测序结果和13个虫草科物种的线粒体全基因组生物信息学比较分析，以及对12株不同地理株系白僵菌rps3基因进行多序列对比分析的基础上，发现不同地理株系白僵菌的rps3序列的部分位点存在碱基的替换现象，因此选择基因rps3作为白僵菌线粒体全基因组的分子标记应用于中药材僵蚕中白僵菌真伪鉴别，为僵蚕的真伪鉴别提供了理论基础。同时，通过提取广东株白僵菌基因组总DNA，构建高通量测序文库，采用lluminaHiseq2500平台进行测序；denovo的方法将测序数据组装成完整的白僵菌线粒体基因组序列。基于广东株白僵菌线粒体全基因序列设计筛选出了1对能特异检测白僵菌的引物，特异性好、灵敏度高，从而为不同产地市售僵蚕中基原白僵菌真伪鉴别的提供新的分子鉴定方法。利用本专利技术设计的这对特异鉴定白僵菌的引物对不同产地市售僵蚕中白僵菌真伪进行鉴别，最终通过PCR扩增、电泳、测序及数据对比，构建系统进化树，为僵蚕中白僵菌的分子鉴定提供了实验参考和理论依据，为中药材僵蚕的质量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组鉴定验证僵蚕中白僵菌真伪的引物组，其特征在于，为引物对F935和R1385，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一组鉴定验证僵蚕中白僵菌真伪的引物组，其特征在于，为引物对F935和R1385，序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述引物组在鉴定验证僵蚕中白僵菌真伪中的应用。3.权利要求1所述引物组在构建快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法中的应用。4.权利要求1所述引物组在制备快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的试剂盒中的应用。5.一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法，其特征在于，以待测中药材白僵蚕总DNA为模板，利用引物组F935/R1385进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR扩增结果有无清晰的500bp目的电泳条带来判断待测中药材白僵蚕样品中是否含有白僵菌。6.根据权利要求5所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述白僵蚕总DNA的提取方法为：先将白僵蚕预处理成粉末后，进行总DNA提取；所述预处理是指...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉平，刘健霞，陈杰湖，李香霖，何青，李峙贤，刘希，吕思行，米红霞，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44