重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法技术

本发明专利技术公开了重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，它包括以下步骤：①、制备标准品溶液；②、制备供试品溶液；③、测定吸光度，记录测定结果，试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，计算供试品的生物学活性。本发明专利技术提供的重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，操作简便，容易观察，且具有良好的线性关系，重复性好，特异性强，为监控其产品质量提供了一种行之有效的技术手段。

Method for detecting biological activity of recombinant human interleukin 1 receptor antagonist eye drops

The invention discloses a method for detection of recombinant human interleukin 1 receptor antagonist eye drops biological activity. It includes the following steps: 1, the preparation of standard solution; second, preparation of the test solution; third, absorbance was measured, the results were recorded and the test data using a computer program or four parameter regression the calculation method, calculation of biological samples. Detection method of recombinant human interleukin 1 provided receptor antagonist eye drops biological activity has the advantages of simple operation, easy observation, and has a good linear relationship, good reproducibility, specificity, and provides an effective technical means for monitoring the quality of their products.

【技术实现步骤摘要】
重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法
本专利技术属于生物药物活性的检测领域，具体涉及重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法。
技术介绍
IL-1ra能与IL-1在T淋巴细胞上的受体竞争性结合，从而抑制IL-1的生物学活性，根据这一原理建立了IL-1ra生物学活性的多种检测方法：IL-1ra抑制IL-1诱导的小鼠胸腺细胞增生实验；IL-1ra抑制IL-1诱导的人皮成纤维细胞分泌PGE2实验及抑制其他T淋巴细胞株如D10AG4.1和D10(N4)增殖的实验。但以上方法存在有很多不足之处，如PGE2的检测步骤较多；小鼠胸腺细胞法由于活体个体差异，使结果很不稳定；其他T淋巴细胞除对IL-1有增殖作用外，对其他细胞因子同样有作用，特异性较差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，具有良好的线性关系，重复性好，特异性强，为监控其产品质量提供了一种行之有效的技术手段。本专利技术提供的重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，它包括以下步骤：①、制备标准品溶液；②、制备供试品溶液；③、在加有标准品溶液和供试品溶液的培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时～108小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝溶液，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液，吹打以充分溶解还原物；所述裂解液是由以下方法制成：取1ml盐酸、5mlTritonX-100，加异丙醇，配制成100ml的溶液；将培养板放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果；试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：式中，Pr为标准品的生物学活性，U/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效量的稀释倍数。进一步的，步骤①中，所述标准品溶液是由以下方法制成：将rhIL-1ra标准品10μg用1.25ml水溶解，然后用培养液B2稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B2是培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液。进一步的，所述rhIL-1ra标准品的比活性为1U/mg；所述rhIL-1β的比活性≥1×107U/mg。进一步的，步骤②中，所述供试品溶液是由以下方法制成：取rhIL-1ra滴眼液，加培养液B2，至rhIL-1ra浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B2是培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液。进一步的，所述rhIL-1ra滴眼液是由以下方法制成：rhIL-1ra50mg、人血白蛋白1g、甘露醇60g、氯化钠70g、氯化钾2g、磷酸氢二钠14.4g、磷酸二氢钾2.4g，加水，配制成1000ml的溶液。进一步的，步骤③中，所述A375-s2细胞悬液的细胞浓度为6×104个/ml～7×104个/ml；优选的，所述A375-s2细胞悬液的细胞浓度为7×104个/ml。进一步的，所述A375-s2细胞悬液是由以下方法制成：取对数生长期的A375-s2细胞，胰蛋白酶消化计数后，用培养液A调细胞浓度为6×104个/ml～7×104个/ml；所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液。进一步的，步骤③中，所述噻唑蓝溶液是由以下方法制成：取噻唑蓝0.1g，加PBS溶解并稀释至20ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，即得。进一步的，所述PBS是由以下方法制成：取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌，即得。进一步的，步骤③中，所述的盐酸含HCl为36％～38％。本专利技术提供的重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，操作简便，容易观察，且具有良好的线性关系，重复性好，特异性强，为监控其产品质量提供了一种行之有效的技术手段。关于本专利技术使用的术语的定义：除非另有说明，本文中术语提供的初始定义，适用于全文的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应当根据公开内容、上下文以及本领域的常识，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。例如：3倍系列稀释，即在96孔培养板中每孔预先加入100μl培养液，取50μl标准品溶液或供试品溶液加入其中，成为1:3稀释度，充分混合后，吸取50μl加入下一孔100μl培养液中，成为1:9稀释度，如此系列稀释若干孔至适宜稀释度(参见：《中华人民共和国药典》三部.国家药典委员会编.中国医药科技出版社.)。噻唑蓝(MTT)法的基本原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝色结晶物(Formazan)，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能；并且，Formazan的产量与线粒体的数量和细胞活跃程度呈线性关系，用裂解液溶解结晶物后可用酶标仪测定其光吸收值。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1为本专利技术实施例1的生物学活性测定曲线。图2为本专利技术实施例1的线性拟合。具体实施方式本专利技术具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。材料：A375-s2细胞(人黑色素瘤细胞：购于ATCC，CRL-1872)；rhIL-1β(重组人白细胞介素-1β：比活性≥1×107U/mg，R&D生产)；rhIL-1ra标准品(1U/mg，NIBSC)；培养液A：含10％新生牛血清(NBS)的DMEM培养液；培养液B1：培养液A加入rhIL-1β至0.5ng/ml；培养液B2：培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml；培养液B3：培养液A加入rhIL-1β至4ng/ml；PBS：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌；噻唑蓝(MTT)溶液：5mg/ml，配制方法如下：称取噻唑蓝(MTT)0.1g，加PBS溶解并稀释至20ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存；TritonX-100：液体，Sigma-Aldrich公司；盐酸：含HCl为36％～38％(参见：《中华人民共和国药典》三部.国家药典委员会编.中国医药科技出版社.)。重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)滴眼液的制备配方：rhIL-1ra(通过购买市售产品获得，或者，按照现有的方法制本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：①、制备标准品溶液；②、制备供试品溶液；③、在加有标准品溶液和供试品溶液的培养板中，每孔加入A375‑s2细胞悬液100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时～108小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝溶液，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液，吹打以充分溶解还原物；所述裂解液是由以下方法制成：取1ml盐酸、5ml Triton X‑100，加异丙醇，配制成100ml的溶液；将培养板放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果；试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：

【技术特征摘要】
1.重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：①、制备标准品溶液；②、制备供试品溶液；③、在加有标准品溶液和供试品溶液的培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时～108小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝溶液，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液，吹打以充分溶解还原物；所述裂解液是由以下方法制成：取1ml盐酸、5mlTritonX-100，加异丙醇，配制成100ml的溶液；将培养板放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果；试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：式中，Pr为标准品的生物学活性，U/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效量的稀释倍数。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤①中，所述标准品溶液是由以下方法制成：将rhIL-1ra标准品10μg用1.25ml水溶解，然后用培养液B2稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B2是培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述rhIL-1ra标准品的比活性为1U/mg；所述rhIL-1β的比活性≥1×107U/mg。4.根据权利要求1～3任意一项所述的检测方法，其特征在于：步骤②中，所述供试品溶液是由...

【专利技术属性】
技术研发人员：任东升，何晨，周菊萍，冯海燕，刘希望，张艳，
申请(专利权)人：西藏诺迪康药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：西藏,54