重组酶硫酸乙酰肝素3‑O磺基转移酶的表达方法及其在合成硫酸乙酰肝素中的应用技术

本发明专利技术公开了重组酶硫酸乙酰肝素3‑O磺基转移酶的表达方法及其在合成硫酸乙酰肝素中的应用。利用Wistar大鼠脑组织来源的RNA为模板进行反转录，得到3‑O‑硫酸转移酶‑1的互补脱氧核糖核酸序列，进行密码子优化并切除信号肽；优化后的片段与pET‑28a质粒连接，导入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。得到表达后，使用镍亲和柱进行纯化去除杂蛋白；并利用透析法对包涵体进行复性；通过3’‑磷酸腺苷‑5’‑磷酰硫酸再生系统，对复性后蛋白进行酶活检测，并应用于底物N‑脱乙酰/硫酸化的heparosan(NSNAH)的硫酸化修饰中。本发明专利技术可有效地获得重组酶硫酸乙酰肝素3‑O磺基转移酶的表达，并成功用于合成硫酸乙酰肝素。

Application of recombinant enzyme heparan sulfate 3 O disodoum transfer enzyme and its expression method in the synthesis of heparan sulfate.

The invention discloses application of recombinant enzyme heparan sulfate 3 O sulfotransferase expression method in the synthesis of heparan sulfate. As the template for reverse transcription using brain tissue from rat Wistar RNA complementary DNA sequences of 3 O sulfotransferase 1, codon optimization and excision of signal peptide fragment; optimized connected with pET 28a plasmid into E. coli BL21 (DE3) were induced the expression of. Expression, purification of impure protein removal using a nickel affinity column; and the inclusion bodies were refolded by dialysis method; regeneration system through 3 '5' amp monophosphosulfate, the refolded protein enzyme activity detection, and applied to the substrate of N deacetylation / sulfated heparosan (NSNAH) sulfated modification. The invention can effectively obtain the recombinant enzyme expression of 3 O heparan sulfate sulfotransferase, and successfully used in the synthesis of heparan sulfate.

【技术实现步骤摘要】
重组酶硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶的表达方法及其在合成硫酸乙酰肝素中的应用
本专利技术涉及重组酶硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶的表达方法及其在合成硫酸乙酰肝素中的应用。
技术介绍
硫酸乙酰肝素(HS)是一类广泛存在于细胞表面的糖胺聚糖，参与一系列生物反应，如血液凝固、伤口愈合、胚胎发育等。它与肝素的结构相似，都是由重复的双糖单位组成。硫酸乙酰肝素是由葡萄糖胺和葡萄糖醛酸相互交替增加到链的非还原端形成。随后，通过一系列的反应进行修饰，包括N-脱乙酰、N-硫酸化、C5异构化与不同位置和程度的硫酸化。由于这些反应的不完全性，合成的多糖也具有不同的结构和功能。而HS与不同的蛋白相互作用取就是决于多糖链上O-硫酸化位点与程度。近年来有研究表明，HS及其衍生物在参与病毒感染中发挥着重要作用。尤其是3-O硫酸化的HS能与抗凝血酶，HSV-1糖蛋白D，纤维细胞生长因子等结合，发挥特定功能。硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶1(3-O-硫酸转移酶-1)是硫酸乙酰肝素生物合成中的关键酶。它能将硫酸基团转移到葡萄糖胺的3-O位上。3-O-硫酸转移酶-1的表达与应用对于体外合成硫酸乙酰肝素及其功能研究具有重要意义。而目前，国内外关于3-O-硫酸转移酶-1高效外源表达的报道还十分有限，相关研究也并未深入展开。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种有效可行的方法，通过构建基因工程，获得重组酶硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶的表达，并将其应用于硫酸乙酰肝素的合成中。为实现第一个专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：重组酶硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶的表达方法，其特征在于，利用Wistar大鼠脑组织来源的RNA为模板进行反转录，得到3-O-硫酸转移酶-1的互补脱氧核糖核酸序列，进行密码子优化并切除信号肽；优化后的片段与pET-28a质粒连接，导入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。具体地，有如下步骤：(1)实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：根据已报道的褐家鼠3-O-硫酸转移酶-1基因(GenBank登录号：NO.NM_053391.1)设计了一对特异性引物，在引物中加入限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点；以Wistar大鼠大脑总核糖核酸为模板，利用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增得到3-O-硫酸转移酶-1基因片段；将PCR得到的片段与pMD-19-T载体连接，并导入大肠杆菌DH5α感受态中，用蓝白斑筛选与菌落聚合酶链式反应进行验证；(2)密码子优化：对序列进行稀有密码子分析，同时进行密码子优化；(3)表达：密码子优化后的基因连接在pET-28a载体，利用热转法将质粒导入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中；抗性筛选后，利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，使目的蛋白表达；对诱导后的细胞进行超声破碎，破碎液作为总蛋白样品，离心取上清与沉淀分别作为可溶性与非可溶性蛋白样品，进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)。为实现第二个专利技术目的，采用的技术方案如下：重组酶硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶在合成硫酸乙酰肝素中的应用，其特征在于，得到表达后，使用镍亲和柱进行纯化去除杂蛋白；并利用透析法对包涵体进行复性；通过3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸再生系统，对复性后蛋白进行酶活检测，并应用于底物N-脱乙酰/硫酸化的heparosan(NSNAH)的硫酸化修饰中。具体地，有如下步骤：(4)复性：对于无生物活性的包涵体，必须经复性使其正确折叠为可溶性蛋白。本实验采取透析方式进行复性。主要方法是将包涵体溶解于变性液中，并装入透析袋。透析液初始为含6M尿素的变性液，而后以0.8mL/min的速度加入1.5L复性液；(5)酶活测定：复性结束后，10000rpm离心10min，取上清，即为复性成功的可溶性的目的蛋白。利用3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸再生系统进行酶活测定。3-O-硫酸转移酶-1的酶活定义为37℃，pH7.0的条件下1min内转化1nmol底物或1nmol硫酸基团的酶量。酶活计算公式如下：公式中各参数的意义：Abst＝5和Abst＝20分别是酶促反应5min和20min时反应体系的OD400值，ε0摩尔消光系数数值为10.5×10-3，RT为反应时间，[3OST]为酶的浓度，1表示反应体系的体积，1000表示μmol到nmol的单位转换。(6)3-O-硫酸转移酶-1对NSNAH的硫酸化修饰：反应总体积为20ml，实验组中依次加入20mgNSNAH、8mL3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸、5mL芳香磺基转移酶(AST-IV)、3-O-硫酸转移酶-1蛋白5mL；将其于37℃温浴5分钟后，加入2ml3’-磷酸腺苷-5’-磷酸；反应在37℃中进行，每隔10分钟测定实验组与对照组在400nm处的吸光值，直到OD值不再发生变化；将样品煮沸5分钟，过滤除蛋白后，进行透析、浓缩并冻干。本专利技术可有效地获得重组酶硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶的表达，并成功用于合成硫酸乙酰肝素。附图说明图1为实施例一的3-O-硫酸转移酶-1PCR扩增凝胶电泳图。图2为实施例一的3-O-硫酸转移酶-1基因序列。图3为实施例一的3-O-硫酸转移酶-1基因序列优化前后的对比。图4为实施例一的3-O-硫酸转移酶-1诱导表达后的对照电泳图。图5为实施例二的3-O-硫酸转移酶-1复性后的对照电泳图。图6为实施例二中NSNAH(a)与NSNA3SHp(b)的1H-NMR核磁共振图谱对比图。具体实施方式实施例一重组酶硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶的表达(1)实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：根据已报道的褐家鼠3-O-硫酸转移酶-1基因(GenBank登录号：NO.NM_053391.1)设计了一对特异性引物，在引物中加入限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点。以Wistar大鼠大脑总RNA为模板，利用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增得到3-O-硫酸转移酶-1基因片段。将PCR得到的片段与pMD-19-T载体连接，并导入大肠杆菌DH5α感受态中，用蓝白斑筛选与菌落聚合酶链式反应进行验证。结果如图1(泳道1：标记；泳道2、3：3-O-硫酸转移酶-1聚合酶链式反应DNA片段)。从图中可以发现，在1000bp处存在明显条带，且该PCR产物与美国国家生物技术信息中心(NCBI)报道的褐家鼠3-O-硫酸转移酶-1基因(936bp)长度基本一致。为进一步确定PCR产物，将其交由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。测序结果见图2。利用软件(DNAMAN)对比测序结果与褐家鼠3-O-硫酸转移酶-1基因序列。可以发现，两者同源性为99％，存在5个碱基的差异。(2)密码子优化：对序列进行稀有密码子分析，同时委托苏州泓迅生物科技有限公司进行密码子优化。优化前后的序列对比如图3。(3)表达：密码子优化后的基因连接在pET-28a载体。利用热转法将质粒导入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中。抗性筛选后，利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，使目的蛋白表达。对诱导后的细胞进行超声破碎，破碎液作为总蛋白样品，离心取上清与沉淀分别作为可溶性与非可溶性蛋白样品，进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)。经聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，目的蛋白主要本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组酶硫酸乙酰肝素3‑O磺基转移酶的表达方法，其特征在于，利用Wistar大鼠脑组织来源的RNA为模板进行反转录，得到3‑O‑硫酸转移酶‑1的互补脱氧核糖核酸序列，进行密码子优化并切除信号肽；优化后的片段与pET‑28a质粒连接，导入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。

【技术特征摘要】
1.重组酶硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶的表达方法，其特征在于，利用Wistar大鼠脑组织来源的RNA为模板进行反转录，得到3-O-硫酸转移酶-1的互补脱氧核糖核酸序列，进行密码子优化并切除信号肽；优化后的片段与pET-28a质粒连接，导入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：根据已报道的褐家鼠3-O-硫酸转移酶-1基因(GenBank登录号：NO.NM_053391.1)设计了一对特异性引物，在引物中加入限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点；以Wistar大鼠大脑总核糖核酸为模板，利用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增得到3-O-硫酸转移酶-1基因片段；将PCR得到的片段与pMD-19-T载体连接，并导入大肠杆菌DH5α感受态中，用蓝白斑筛选与菌落聚合酶链式反应进行验证；(2)密码子优化：对序列进行稀有密码子分析，同时进行密码子优化；(3)表达：密码子优化后的基因连接在pET-28a载体，利用热转法将质粒导入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中；抗性筛选后，利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，使目的蛋白表达；对诱导后的细胞进行超声破碎，破碎液作为总蛋白样品，离心取上清与沉淀分别作为可溶性与非可溶性蛋白样品，进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)。3.重组酶硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶在合成硫酸乙酰肝素中的应用，其特征在于，如权利要求1或2所述得到表达后，使用镍亲和柱进行纯化去除杂蛋白；并利用透析法对包...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟卫鸿，金维华，陈家乐，李学亮，黄海婵，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33