ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了ω‑转氨酶突变体及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。ω‑转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示。本发明专利技术还提供了编码ω‑转氨酶突变体的基因、包含该基因的表达单元、重组质粒和转化子。本发明专利技术制备方法利用NCBI数据库和BLAST软件比对筛选获得与ω‑转氨酶同源的氨基酸序列，通过Weblogo程序得到序列一致性结果，并结合ω‑转氨酶的序列确定需要突变的氨基酸残基位点，通过定点突变技术进行实验验证。该方法可有效地提高正突变概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性明显优于野生酶的突变酶。

【技术实现步骤摘要】
ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
手性胺是一类有重要价值的医药及精细化工中间体，对手性胺类化合物的不对称合成进行深层次研究具有较大的经济效益和应用价值。目前，超过70％的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体。转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力，已成为工业上用于生产氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要农药或医药中间体的常用酶之一。来自于土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺，催化氨基供体上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺和副产物酮，反应过程需要磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate，PLP)的参与，催化过程如下所示：实验表明，ω-转氨酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，不利于应用到工业生产中，其热稳定性有待进一步提高。如CN105441404A、CN105950581A公开了利用定点突变技术对ω-转氨酶野生型进行改造，获得热稳定性进一步提高的ω-转氨酶突变体，使其更适合工业应用。在自然进化过程中，某一特定位置上出现频率较高的氨基酸一般是对蛋白质结构和功能是有利的，不合适的氨基酸逐渐消失，从而使该位点上的氨基酸慢慢趋于一致，那么把不一致的氨基酸突变成为一致性的氨基酸对于蛋白质的稳定性起着重要的作用。目前尚无通过将转氨酶序列中不一致的氨基酸突变成一致性的氨基酸来提高其热稳定性的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于序列一致性分析选择氨基酸突变位点制备生物酶突变体的方法，通过该方法获得酶活、热稳定性进一步提高的ω-转氨酶突变体。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种生物酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(1)利用BLAST比对筛选获得与野生型生物酶同源的氨基酸序列，通过分析序列一致性，选择与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为需要突变的位点；(2)针对需要突变的位点设计定点突变引物，以野生型生物酶基因为模板，进行定点PCR扩增，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；(3)从定点突变文库中筛选获得生物酶突变体。本专利技术依据在自然进化过程中，同源蛋白质的氨基酸序列某些特定位置向蛋白质结构和功能有利的方面趋于一致的机制，利用生物信息学技术筛选出与待改造生物酶同源的序列，并进行序列一致性分析，确定待改造生物酶中与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为突变对象，进而利用定点突变技术进行改造。本专利技术利用NCBI数据库和BLAST软件比对筛选获得与野生型生物酶同源的氨基酸序列，作为优选，步骤(1)中，BLAST比对的条件为：E-value最大值为10-3，序列冗余度不超过0.9。作为优选，步骤(1)中，采用Weblogo程序(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)进行序列一致性分析，突变的保守性阈值为0.6，即在多序列比对中该位点氨基酸类型所占的比例达到60％以上。基于序列一致性筛选定点突变位点，可有效提高突变位点选择的准确率，降低筛选工作量，节省时间，提高实验效率。采用上述方法获得的突变体比野生转氨酶具有更好的热稳定性，更好的酶活性，从而证明了本专利技术突变位点预测筛选方案的可行性。作为优选，所述野生型生物酶为土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶。本专利技术还提供了利用上述方法获得的ω-转氨酶突变体，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4或SEQIDNO.6或SEQIDNO.8或SEQIDNO.10或SEQIDNO.12所示。氨基酸序列如SEQIDNO.2的ω-转氨酶突变体是第77位的氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，该突变体(I77L)的半失活温度为42.8±0.7℃，比野生型ω-转氨酶提高了4.3℃，突变体(I77L)在40℃下的半衰期为17.0±0.6min，比野生型ω-转氨酶延长10.1min。氨基酸序列如SEQIDNO.4的ω-转氨酶突变体是第97位的氨基酸由谷氨酰胺突变为谷氨酸，该突变体(Q97E)的半失活温度为41.7±0.3℃，比野生型ω-转氨酶提高了3.2℃，突变体(Q97E)在40℃下的半衰期为16.5±0.6min，比野生型ω-转氨酶延长9.6min。氨基酸序列如SEQIDNO.6的ω-转氨酶突变体是第210位的氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺，该突变体(H210N)的半失活温度为44.9±0.7℃，比野生型ω-转氨酶提高了6.4℃，突变体(H210N)在40℃下的半衰期为32.7±1.3min，比野生型ω-转氨酶延长25.8min；酶活性约是野生型酶的1.7倍。氨基酸序列如SEQIDNO.8的ω-转氨酶突变体是第245位的氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸，该突变体(N245D)的半失活温度为41.4±0.3℃，比野生型ω-转氨酶提高了2.9℃，突变体(N245D)在40℃下的半衰期为14.8±0.6min，比野生型ω-转氨酶延长7.9min。氨基酸序列如SEQIDNO.10的ω-转氨酶突变体是第292位的氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸，该突变体(G292D)的半失活温度为41.3±0.5℃，比野生型ω-转氨酶提高了2.8℃，突变体(G292D)在40℃下的半衰期为14.8±0.8min，比野生型ω-转氨酶延长7.9min。氨基酸序列如SEQIDNO.12的ω-转氨酶突变体是第295位的氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸，该突变体(I295V)的半失活温度为38.7±0.2℃，比野生型ω-转氨酶提高了0.2℃，突变体(I295V)在40℃下的半衰期为9.3±0.5min，比野生型ω-转氨酶延长2.4min。本专利技术还提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。作为优选，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3或SEQIDNO.5或SEQIDNO.7或SEQIDNO.9或SEQIDNO.11所示。本专利技术还提供了包含所述基因的表达单元、重组质粒和转化子。表达单元的启动子可以为常用的T7启动子、Iac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，ω-转氨酶的突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。所述重组质粒的原始载体为质粒pET28a(+)。所述转化子的宿主细胞为大肠杆菌细胞。本专利技术还提供了所述的ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。相较于野生型酶，突变体酶在较高温条件下具有较好的热力学稳定性，更适合工业应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术方法利用NCBI数据库和BLAST软件比对筛选获得与ω-转氨酶同源的氨基酸序列，通过Weblogo程序得到序列一致性结果，并结合ω-转氨酶的序列确定需要突变的氨基酸残基位点，通过定点突变技术进行实验验证。该方法可有效地提高正突变概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性、酶活性明显优于野生酶的突变酶。附图说明图1为质粒pET28a(+)-ω-AT的基因图谱；图2为ω-转氨酶序列一致本文档来自技高网...

【技术保护点】
ω‑转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示。

【技术特征摘要】
1.ω-转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4或SEQIDNO.6或SEQIDNO.8或SEQIDNO.10或SEQIDNO.12所示。2.编码如权利要求1所述ω-转氨酶突变体的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3或SEQIDNO.5或SEQIDNO.7或SEQIDNO.9或SEQIDNO.11所示。4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达单元。5.一种包含权利要求4所述表达单元的重组质粒。6.一种包含权利要求5所述重组质粒的转化子。7.一种生物酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(1)利用BLAST比对筛选获得与...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊，谢东芳，方卉，梅乐和，王宏鹏，胡升，吕常江，赵伟睿，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33