一种参与紫草素生物合成的AePGT‑6蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种参与紫草素生物合成的AePGT‑6蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术提供了的蛋白质，获自新疆紫草，命名为AePGT‑6蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。本发明专利技术提供的AePGT‑6蛋白与紫草素类化合物合成代谢密切相关，能催化对PHBA和GPP结合形成GBA。本发明专利技术对于调节生产植物萘醌类化合物和通过生物技术提高新疆紫草中萘醌类活性成分紫草素类的含量具有重要的理论和实际意义。

【技术实现步骤摘要】
一种参与紫草素生物合成的AePGT-6蛋白及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种参与紫草素生物合成的AePGT-6蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
药用植物活性成分通常是植物生长发育和适应环境过程中次生代谢产生的一类小分子有机化合物。活性成分生物合成途径的解析是药用植物次生代谢产物研究的核心内容。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为诠释药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johns是传统中药材紫草ArnebiaeRadix的重要来源，已被列为野生药材动植物资源三类保护品种。新疆紫草的有效化学成分主要分为两大类，一类是脂溶性的萘醌类化合物，紫草素类化合物；另一类是水溶性成分，主要是多糖类和酚酸类。现代药理学研究发现紫草素类化合物具有抗肿瘤、抗HIV活性、调节免疫、抗生育、抗血栓、镇静、促进伤口愈合等多种临床作用，在医药行业应用广泛。此外，紫草素更是重要的天然染料被国际上称为“天然红色素之王”，具有很高的经济价值。紫草素为萘醌类化合物，在植物体内通过苯丙氨酸(Phenylalaninepathway，PP)-甲羟戊酸(Mevalonatepathway，MVA)/去氧木酮糖磷酸(2-C-methyl-D-erythritol4-phosphate，MEP)途径复合途径合成，由一分子对-羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoicacid，PHBA)和一分子焦磷酸香叶酯(Geranylpyrophosphate，GPP)结合，形成紫草素的基本骨架——香叶烯基对羟基苯甲酸(3-Geranyl-4-hydroxybenzoicacid，GBA)，GBA为再经过一系列的脱羧、加氧、脱氢生成紫草素。对-羟基苯甲酸香叶烯基转移酶(4-hydroxybenzoateGeranyltransferase，PGT)将两个途径联系起来，属于紫草素生物合成过程的特有酶促反应，能够催化GPP和PHBA结合产生GBA。对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶(PGT)是紫草细胞中紫草素衍生物生物合成的一个关键而重要的代谢酶，它将甲羟戊酸代谢途径形成的GPP的香叶烯基转移到来自苯丙素类代谢途径的PHBA上形成香叶烯基对羟基苯甲酸(GBA)，最终反应生成紫草素及其衍生物。PGT位于紫草细胞的内质网膜上，增加或减少它的活性直接影响到紫草素的产生，故在紫草素形成的过程中起着重要的作用。在紫草培养细胞中，PGT基因的表达模式与其酶活性变化和紫草素及其衍生物的形成具有高度的一致性，可见PGT基因的表达水平对调控紫草素及其衍生物形成的重要性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种参与紫草素生物合成的AePGT-6蛋白及其编码基因与应用。本专利技术提供了一种蛋白质，获自新疆紫草，命名为AePGT-6蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。为了使(a1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。本专利技术还保护编码AePGT-6蛋白的基因(AePGT-6基因)。所述AePGT-6基因为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。本专利技术还保护AePGT-6蛋白的应用，为如下(c1)和/或(c2)：(c1)作为对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶；(c2)催化对羟基苯甲酸和焦磷酸香叶酯反应产生香叶烯基-对羟基苯甲酸。本专利技术还保护一种重组菌(重组菌甲)，是将AePGT-6基因导入宿主菌中得到的；所述宿主菌不能生产焦磷酸香叶酯。本专利技术还保护一种重组菌(重组菌乙)，是将AePGT-6基因导入宿主菌中得到的；所述宿主菌可以生产焦磷酸香叶酯。所述可以生产焦磷酸香叶酯的宿主菌具体可为酿酒酵母K197G。所述AePGT-6基因可通过含有AePGT-6基因的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。可用现有的表达载体构建含有AePGT-6基因的重组表达载体。使用AePGT-6基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；此外，使用AePGT-6基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。所述重组表达载体具体可为将pESC-His质粒BamHI和ApaI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列2自5’端第1-924位核苷酸所示的DNA分子得到的重组表达载体。本专利技术还保护一种对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶的制备方法，包括如下步骤：培养以上任一所述重组菌，从重组菌中得到对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶。所述培养以上任一所述重组菌包括如下步骤：(a1)将重组菌接种至SD-His-Ura培养基中培养，得到菌液；(a2)将步骤(a1)培养后的菌液离心收集沉淀；(a3)使用含2％(质量百分比)半乳糖的SD-His-Ura培养基重悬步骤(a2)得到的菌体，继续培养。步骤(a1)中，所述培养具体可为30℃、200r.min-1培养。步骤(a1)中，所述菌液OD600nm＝0.6。步骤(a2)中，所述离心具体可为3000g离心。步骤(a3)中，所述培养具体可为30℃、200r.min-1培养。步骤(a3)中，所述培养时间具体可为48h。所述培养以上任一所述重组菌还包括完成步骤(a3)后，收集培养体系，离心收集菌体沉淀。所述离心具体可为3000g离心。所述从重组菌中得到对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶的方法具体可为从所述菌体沉淀中提取酵母微粒体蛋白，得到对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶。所述提取酵母微粒体蛋白具体可采用玻璃珠法。本专利技术还保护以上任一所述重组菌在制备对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶产品中的应用。本专利技术还保护香叶烯基对羟基苯甲酸的制备方法，为方法甲或方法乙。所述方法甲包括如下步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。4.权利要求1所述的蛋白质的应用，为如下(c1)和/或(c2)：(c1)作为对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶；(c2)催化对羟基苯甲酸和焦磷酸香叶酯反应产生香叶烯基-对羟基苯甲酸。5.一种重组菌，是将权利要求2或3所述的基因导入宿主菌中得到的；所述宿主菌不能生产焦磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，王升，郭兰萍，王瑞杉，詹志来，康利平，刘谈，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11