一种链霉菌抗生素生物合成基因簇多拷贝扩增方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种链霉菌抗生素生物合成基因簇多拷贝扩增方法及应用。本发明专利技术在删减一些不相关基因簇的同时、引入多个attB位点，借助位点特异性重组系统，一次实现目标基因簇多拷贝扩增，大幅提高目标产物产量。本发明专利技术的方法不仅操作简单有效，而且工程菌的遗传稳定性良好。

Multiple copy amplification method of Streptomyces antibiotic biosynthesis gene cluster and application thereof

The invention relates to a multi copy amplification method of Streptomyces antibiotic biosynthesis gene cluster and an application thereof. In the invention, a plurality of attB loci are introduced at the same time of deleting some unrelated gene clusters, and a target specific recombination system is used to realize multiple copy amplification of target gene clusters at a time, and the yield of target products is greatly improved. The method of the invention not only is simple and effective in operation, but also has good genetic stability of Engineering bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一种链霉菌抗生素生物合成基因簇多拷贝扩增方法及应用
本专利技术属于代谢工程领域，更具体地，本专利技术涉及一种链霉菌抗生素生物合成基因簇多拷贝扩增方法及应用。
技术介绍
微生物产生的具有生物活性的天然产物(又称次级代谢产物)，是人类抵抗癌症、衰老和感染性疾病等的宝贵财富。以抗生素为例，据统计，在已报道的天然来源的抗生素中，有50％左右是由放线菌科的链霉菌产生的。抗生素生物合成基因簇包含了结构、抗性、外排、调控与后修饰等基因，基因簇大小一般在20-150kb不等。伴随着代谢工程的迅速发展，通过设计提高抗生素产量的策略被开发与应用，包括优化调控网络、减少竞争途径、提高耐受性、增加前体供给等。这些策略避免了传统诱变筛选时所需大量的时间与人力成本，可有效优化次级代谢产物的生物合成。链霉菌属于放线菌目的链霉菌科，为一种原核生物，其是放线菌的典型代表，属于好氧菌。其广泛分布于含水量较低、通气良好、有机质丰富和微碱性的土壤中，在淡水、海水及淤泥中也有分布。始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)是一种在适当的条件下，可以生产原始霉素(Pristinamycin)的链霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使链霉菌基因组中整合入多拷贝目标基因或目标基因簇的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)在链霉菌基因组中引入至少1个外源的attB位点，获得携带有外源attB位点的链霉菌；(2)通过接合转移的方法，将目标基因或目标基因簇引入到步骤(1)的链霉菌中，选择目标基因或目标基因簇整合到链霉菌基因组内源attB位点以及外源attB位点的链霉菌，从而获得整合入多拷贝基因或基因簇的链霉菌。

【技术特征摘要】
1.一种使链霉菌基因组中整合入多拷贝目标基因或目标基因簇的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)在链霉菌基因组中引入至少1个外源的attB位点，获得携带有外源attB位点的链霉菌；(2)通过接合转移的方法，将目标基因或目标基因簇引入到步骤(1)的链霉菌中，选择目标基因或目标基因簇整合到链霉菌基因组内源attB位点以及外源attB位点的链霉菌，从而获得整合入多拷贝基因或基因簇的链霉菌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的至少1个外源的attB位点为1-2个外源的attB位点；较佳地为2个外源的attB位点。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的1-2个外源的attB位点引入到链霉菌基因组中选自以下的1-2个位置：链霉菌基因组中I型聚酮生物合成基因簇所在位置，并取代该位置的原I型聚酮生物合成基因簇；链霉菌基因组中非核糖体肽生物合成基因簇所在位置，并取代该位置的原非核糖体肽生物合成基因簇；或链霉菌基因组中III型聚酮生物合成基因簇所在位置，并取代该位置的原III型聚酮生物合成基因簇。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的链霉菌包括：始旋链霉菌，天蓝色链霉菌、玫瑰孢链霉菌或吸水链霉菌。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标基因或目标基因簇包括：原始霉素组份II合成基因簇，原始霉素I合成基因簇，达托霉素合成基因簇或雷帕霉素合成基因簇。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，通过接合转移的方法将目标基因或目标基因簇引入到步骤(1)的链霉菌中的方法包括：将携带外源基因或基因簇的质粒以接合转移的方式导入到步骤(1)的链霉菌中。7.一种链霉菌基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的基因组中包括至少1个外源的attB位点，1个内源的内源attB位点。8.如权利要求7所述的链霉菌基因工程菌，其特征在于，所述的至少1个外源的attB位点为1-2个外源的attB位点；较佳地为2个外源的attB位点。9...

【专利技术属性】
技术研发人员：芦银华，李雷，郑国松，阮丽军，戈梅，姜卫红，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海,31