一种合成醇系香气糖苷高效生物酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种合成醇系香气糖苷高效生物酶及其制备方法，属于生物技术领域，包括CsGT1、CsGT2、CsGT3，所述CsGT1的核苷酸如SEQ ID NO:1所示，氨基酸如SEQ ID NO:2所示；所述的CsGT2的核苷酸如SEQ ID NO:3所示，氨基酸如SEQ ID NO:4所示；所述的CsGT2的核苷酸如SEQ ID NO:5所示，氨基酸如SEQ ID NO:6所示。本发明专利技术通过原核表达其编码的蛋白能够利用多种醇系香气为底物，并合成对应的糖苷，为工业化高效生产香气糖苷提供了生物酶，本发明专利技术的环境友好型酶系方法合成香气糖苷化合物合成方法具有很大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种合成醇系香气糖苷高效生物酶及其制备方法
本专利技术属于生物
，涉及一种合成醇系香气糖苷高效生物酶及其制备方法。
技术介绍
醇系香气具有诱人的花果香，如苯甲醇、苯乙醇具有补肾壮阳、肝保护、抗氧化等生物活性并具备愉悦的花果味，在食品、化妆品、烟草和日化用品中有着广泛的应用；薄荷醇具有薄荷香气，可用作牙膏、香水、饮料和糖果等的赋香剂，医药上用作刺激药，作用于皮肤或粘膜，有清凉止痒作用，内服可用于头痛及鼻、咽、喉炎症等；在全世界每年排出的最常用和用量最大的香料中，芳樟醇几乎年年排在首位，既有紫丁香、铃兰香与玫瑰的花香，又有木香、果香气息，但其游离态香气稳定性差，容易发生异构化，不甚持久；丁子香酚具有浓郁的石竹麝香气味，是康及謦系香精的调合基础，在化妆、皂用、食用等香精的调合中均有使用，同时具有很强的杀菌力，作为局部镇痛药可用于龋齿，且兼有局部防腐作用，其缺点是易挥发变质、难以长久储存；香叶醇香叶醇与橙花醇互为立体异构体，与芳樟醇互为间位异构体，为无色至淡黄色油状液体，具玫瑰味香气，为玫瑰系香精的主剂，是各种花香香精中不可缺少的调香原料，也可看作增甜剂，还可用于配制食品，香皂，日用化妆品香精，但其在空气中易被氧化，限制了其在更大氛围内的应用。糖苷态香气物质是一类不具挥发性，与糖类物质通过糖苷键结合后以糖苷态形式存在的一类香气前体，具有重要的生物和药理功能。随着植物糖苷态香气前体研究的日益深入，大量糖苷态香气物质被分离并鉴定，有些还被证实具有重要的生物活性，如抗菌、抗炎和对神经的保护作用。糖苷态香气提高了游离香气物质的水溶性和稳定性，在特定的条件下，释放出人们需要的香气物质，在化妆品、食品和药物开发领域具有广泛的商业价值(如目前市场上每克香叶醇糖苷的价格为20万人民币)，成为天然产物领域研究的热门课题。在自然界中，糖苷化是植物次生代谢最为重要的修饰反应之一，糖苷物质是由UDP-糖基转移酶催化完成，糖基转移酶可将糖基从活化的供体转移到小分子香气(苷元)上，从而调节受体分子在基体的生物活性、可溶性、亚细胞定位和稳定性。植物醇系香气糖基转移酶研究进展缓慢，限制了香气糖苷在体外的高效合成，制约了香气糖苷物质在食品、化妆品及医药行业的应用。苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，芳樟醇，芳樟醇氧化物，4-羟基香豆素，香叶醇，及顺/反-3-己烯醇，丁香酚等香气物质存在许多植物和水果中，具有怡人的芳香和花果香，但其本身稳定性差，在空气中容易变形变质，影响了其在食品，医药方面的应用，而这些物质的糖基化产物可以显著提高其稳定性，水溶性，降低其毒性，极大地拓宽这些香气物质应用到新的领域，具有很大的商业前景。考虑到醇系香气在生产及生活中具有重要作用，以及糖苷态的醇系化合物能有效的避免游离态苷元的存在的弊端，醇系糖苷化合物的化学合成效率低下，对环境污染大，且对产物没有选择性，因而这种环境友好型酶系方法合成香气糖苷化合物合成方法具有很大的应用价值。目前现有技术中急需一种合成醇系香气糖苷高效生物酶及其制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种合成醇系香气糖苷高效生物酶及其制备方法，通过原核表达其编码的蛋白能够利用多种醇系香气为底物，并合成对应的糖苷，为工业化高效生产香气糖苷提供了生物酶，本专利技术的环境友好型酶系方法合成香气糖苷化合物合成方法具有很大的应用价值。其具体技术方案为：一种合成醇系香气糖苷高效生物酶，包括CsGT1、CsGT2、CsGT3，所述CsGT1的核苷酸如SEQIDNO:1所示，氨基酸如SEQIDNO:2所示；所述的CsGT2的核苷酸如SEQIDNO:3所示，氨基酸如SEQIDNO:4所示；所述的CsGT2的核苷酸如SEQIDNO:5所示，氨基酸如SEQIDNO:6所示。进一步，所述高效生物酶的反应体系为：缓冲液：Tris-HCl和磷酸缓冲液，PH范围为PH6.5-8.5，温度为20-45度。再进一步，所述PH范围为7.0-8.5，温度为30-35度。进一步，所述CsGT1对苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，芳樟醇，芳樟醇氧化物，4-羟基香豆素，香叶醇，及顺/反-3-己烯醇均有活性。一种本专利技术合成醇系香气糖苷高效生物酶的制备方法，包括以下步骤：把上述基因连接到pGEX-4T1载体中，转入BL21或Rosetta(DE3)大肠杆菌中37℃培养至OD600＝0.6-0.8，添加1mMIPTG后，16-18℃、室温或37℃诱导20-24小时，用GST-树脂进行纯化，纯化后的蛋白用SDS-Page进行检测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术通过原核表达其编码的蛋白能够利用多种醇系香气为底物，并合成对应的糖苷，为工业化高效生产香气糖苷提供了生物酶，本专利技术的环境友好型酶系方法合成香气糖苷化合物合成方法具有很大的应用价值。附图说明图1为SDS-Page检测图；图2为活性测定结果，其中图2a为CsGT1，图2b为CsGT2，图2c为CsGT3；图3为酶的温度适用范围，其中图3a为CsGT2，图3b为CsGT3；图4为酶的PH值适用范围，其中图4a为CsGT2，图4b为CsGT3；图5为供体选择结果；图6为实施例2的反应效果图；图7为实施例3的反应效果图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。(1)序列信息本实验前期通过对一系列糖基转移酶的筛选最终得到一条基因CsGT1(核苷酸见序列1，共1455bp；氨基酸见序列2)，通过原核表达发现其编码的蛋白能够利用多种醇系香气为底物，并合成对应的糖苷。随后，又对CsGT1的同源序列进行了克隆，并通过大肠杆菌得到其对应的重组蛋白，分别标记为CsGT2和CsGT3，其序列与CsGT1十分相似，同源性高达95％以上，CsGT2核苷酸和氨基酸分别见序列3和4，CsGT3核苷酸和氨基酸分别见序列5和6。(2)酶制备与检测蛋白的制备，以CsGT1为例子进行说明：把上述基因连接到pGEX-4T1载体中，转入BL21或Rosetta(DE3)大肠杆菌中37℃培养至OD600＝0.6-0.8，添加1mMIPTG后，16-18℃诱导20-24小时(也可以室温或37℃诱导)，用GST-树脂进行纯化，纯化后的蛋白用SDS-Page进行检测如图1所示。(3)活性测定：通过底物扫描确定CsGT1对苯甲醇，苯乙醇，香叶醇，芳樟醇，芳樟醇氧化物，4-羟基香豆素，香叶醇，及顺/反-3-己烯醇等醇系香气均活性很强，并能够高效地合成多种香气对应的糖苷。CsGT2对橙花醇活性最强，而值得注意的是，与CsGT1和CsGT2不同，CsGT3芳樟醇的活性远远大于芳樟醇氧化物。如图2所示。(4)适用范围温度：如图3所示，以CsGT2和CsGT2为例子进行说明。该酶在20-45度范围内均具有较高的催化活性，最适温度为30-35度；PH：如图4所示，以CsGT2和CsGT23为例子进行说明。该酶在PH6.5-8.5范围内均具有较高的催化活性，最适PH为7.0-8.5；反应液：该酶在Tris-HCl和磷酸缓冲液中均具有较高的生物学活性，主要PH在合适的范围均可。供体选择性：该酶除了能形成葡萄糖苷外，还具有合成半乳糖糖苷和葡萄糖醛酸糖苷的能力，但葡萄糖为最佳供体，如图所示。(5)应用举例实施例1以苯甲醇为底物，葡萄本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合成醇系香气糖苷高效生物酶，其特征在于，包括CsGT1、CsGT2、CsGT3，所述CsGT1的核苷酸如SEQ ID NO:1所示，氨基酸如SEQ ID NO:2所示；所述的CsGT2的核苷酸如SEQ ID NO:3所示，氨基酸如SEQ ID NO:4所示；所述的CsGT2的核苷酸如SEQ ID NO:5所示，氨基酸如SEQ ID NO:6所示。

【技术特征摘要】
1.一种合成醇系香气糖苷高效生物酶，其特征在于，包括CsGT1、CsGT2、CsGT3，所述CsGT1的核苷酸如SEQIDNO:1所示，氨基酸如SEQIDNO:2所示；所述的CsGT2的核苷酸如SEQIDNO:3所示，氨基酸如SEQIDNO:4所示；所述的CsGT2的核苷酸如SEQIDNO:5所示，氨基酸如SEQIDNO:6所示。2.根据权利要求1所述的合成醇系香气糖苷高效生物酶，其特征在于，所述高效生物酶的反应体系为：缓冲液：Tris-HCl和磷酸缓冲液，PH范围为PH6.5-8.5，温度为20-45度。3.根据权利要求2所述的合成醇系香气糖苷高效生物酶，其特征在于，所述PH范围为7...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋传奎，荆婷婷，高婷，张娜，董绪平，宛晓春，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34