一种适合HEK293细胞的双顺反子表达载体及其制备方法、表达系统、应用技术方案

本发明专利技术涉及一种适合HEK293细胞的双顺反子表达载体及其制备方法、表达系统、应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术的适合HEK293细胞的双顺反子表达载体，包含如下元件：第一核基质结合区序列‑启动子‑目的基因‑内部核糖体进入位点序列‑筛选标记基因‑Poly A–第二核基质结合区序列。该载体利用优化的MAR序列可以显著提高HEK293细胞转基因表达，克服转基因沉默，实现转基因在宿主细胞中的高效、长期表达。同时可实现目的基因和筛选标记的同时表达，可减少由于不同表达框存在导致的假阳性细胞克隆，提高阳性细胞克隆筛选率，并克服传统载体目的基因与筛选标记基因表达不均衡的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种适合HEK293细胞的双顺反子表达载体及其制备方法、表达系统、应用
一种适合HEK293细胞的双顺反子表达载体及其制备方法、表达系统、应用，属于基因工程

技术介绍
20世纪70年代基因工程技术的发展，使原来利用动物脏器、组织或人类血液提取蛋白质药物转变为利用基因工程生产。药物蛋白包括单克隆抗体、多肽、蛋白，已经成为医药工业的重要部分，并将成为未来医药发展的重要领域。重组药物蛋白的表达系统主要包括E.coli、酵母以及非人源化哺乳动物细胞系。E.coli适合表达分子量较小、结构相对简单的蛋白质，酵母表达系统适合表达分子量较大、结构较复杂、较少糖基化的蛋白质。结构复杂或糖基化修饰对于蛋白质的活性非常重要，非人源化哺乳动物细胞由于具备类似于人类细胞的翻译后加工修饰(post-translationalmodifications，PTMs)，因此，非人源化哺乳动物细胞表达系统是目前药物重组药物蛋白生产的重要平台。常用的非人源化哺乳动物细胞主要包括：如中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)、乳仓鼠胚肾细胞(BabyHamsterKidney，BHK)、NSO小鼠胸腺瘤细胞、SP2/0骨髓瘤细胞、NSO小鼠骨髓瘤细胞。尽管非人源化哺乳动物类细胞表达重组药物蛋白具备安全性和有效性，但是由于PTMs方式不同，尤其是糖基化修饰与人源细胞存在差别。如鼠类细胞缺乏人源细胞的糖基化的机制，表达蛋白容易使人体产生免疫性，导致外来的重组药物蛋白被循环系统清除。HEK293细胞来源于人胚肾细胞，最早由Graham于1977年利用转染腺病毒5型DNA获得，近年来被应用于重组药物蛋白和病毒载体的生产。HEK293能够在SFM悬浮生长、易转染，具备生产重组药物蛋白的优点。对HEK293细胞进行驯化和改造，已经培育出能在SFM生长迅速、转染效率高、表达水平高的细胞系。迄今已有5种由HEK293细胞系生产的药物蛋白获美国FDA或EMA批准生产。HEK293细胞表达系统也存在目的蛋白表达水平低、高产稳定细胞筛选周期长、细胞培养成本高等缺陷，这严重制约着重组蛋白药物的生产。而影响重组蛋白在HEK293细胞中表达的因素众多，表达载体就是其中一个重要因素。此外，在细胞表达系统中，高水平持续稳定表达的细胞株往往难以得到，这是因为转基因转染细胞后的随机整合，使有些转基因发生沉默或者表达水平降低，因此需要从大量细胞克隆株中分离出稳定高效表达的克隆细胞株，这也给基因工程产业化生产带来了很大困扰。核基质结合区序列(matrixattachmentregion，MAR)是限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列，长度为300～3000bp，富含AT碱基对(＞60％)，以及几个短的“共有序列”，如A-box(AATAAAYAAA)、T-box(TTWTWTTWTT)、DNA链解旋序列(AATATATTT或AATATT)、拓扑异构酶II结合位点(GTNWAYATTNATNNR)等。研究表明，MAR序列能提高HEK293细胞附着体载体(episomalvectors)转基因表达水平，同时降低转化株转基因表达水平差异(ModifiedS/MARepisomalvectorsforstablyexpressingfluorescentprotein-taggedtransgeneswithsmallcell-to-cellfluctuations.AnalBiochem.2013)。同时研究还发现野猪的MAR能提高HEK293细胞转基因表达水平(SusscrofamatrixattachmentregionenhancesexpressionofthePiggyBacsystemtransfectedintoHEK293Tcells.BiotechnolLett.2016)。已有研究证明，MAR提高转基因表达与载体上的其他调控元件(regulatoryelements)有关，如MAR与不同启动子组合对提高重组蛋白的表达水平不一等(ImpactofUsingDifferentPromotersandMatrixAttachmentRegionsonRecombinantProteinExpressionLevelandStabilityinStablyTransfectedCHOCells.MolBiotechnol.2014)。公开号为CN102994536A的中国专利技术专利公开了一种双顺反子供表达基因转移体及其制备方法，公开了从5′端起到3′端止依次包括有牛核基质结合区MAR、人工构建的组合启动子CAG、抑制蛋白基因FSTN、内部核糖体进入位点IRES、绿色荧光蛋白AcGFP基因、RabbitglobinpolyA信号区的表达载体，但是其MAR序列来源于牛，不适合人来源的HEK293细胞系，并且该表达载体没有包括筛选标记，不能进行稳定转化细胞株的筛选。公开号为CN106520832A的中国专利技术专利公开了一种双顺反子表达载体，但是由于不同的MAR元件组合对转基因的表达也有不同作用(MatrixattachmentregioncombinationsincreasetransgeneexpressionintransfectedChinesehamsterovarycells.SciRep.2017)，载体的骨架结构与其转染的宿主细胞有关(Cellcompatibilityofaneposimalvectormediatedbythecharacteristicmotifsofmatrixattachmentregions.CurrGeneTher,2016)，适合CHO细胞表达的载体不一定适合HEK293细胞(Evaluatingpost-transcriptionalregulatoryelementsforenhancingtransientgeneexpressionlevelsinCHOK1andHEK293cells.ProteinExprPurif.2010)，因此研发适合HEK293细胞的表达载体有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种适合HEK293细胞的双顺反子表达载体。本专利技术还提供了上述双顺反子表达载体的制备方法。本专利技术还提供了上述双顺反子表达载体的表达系统。本专利技术还提供了上述双顺反子表达载体的应用。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种适合HEK293细胞的双顺反子表达载体，包含如下元件：第一核基质结合区序列-启动子-目的基因-内部核糖体进入位点序列-筛选标记基因-PolyA–第二核基质结合区序列。所述第一核基质结合区序列为人X-29MAR序列、人β-珠蛋白MAR序列、鸡卵溶菌酶MAR序列、人HPRTMAR序列或MAR1-68序列；所述第二核基质结合区序列为人X-29MAR序列、人β-珠蛋白MAR序列、鸡卵溶菌酶MAR序列、人HPRTMAR序列或MAR1-68序列。所述第一核基质结合区序列与第二核基质结合区序列为人X-29MAR序列、人β-珠蛋白MAR序列、鸡卵溶菌酶MAR序列、人HPRTMAR序列或MAR1-68序列中的任意两种。优选的，所述第一核基质结合区序列和第二核基质结合区本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适合HEK293细胞的双顺反子表达载体，其特征在于：包含如下元件：第一核基质结合区序列‑启动子‑目的基因‑内部核糖体进入位点序列‑筛选标记基因‑Poly A–第二核基质结合区序列。

【技术特征摘要】
1.一种适合HEK293细胞的双顺反子表达载体，其特征在于：包含如下元件：第一核基质结合区序列-启动子-目的基因-内部核糖体进入位点序列-筛选标记基因-PolyA–第二核基质结合区序列。2.根据权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于：所述第一核基质结合区序列为人X-29MAR序列、人β-珠蛋白MAR序列、鸡卵溶菌酶MAR序列、人HPRTMAR序列或MAR1-68序列；所述第二核基质结合区序列为人X-29MAR序列、人β-珠蛋白MAR序列、鸡卵溶菌酶MAR序列、人HPRTMAR序列或MAR1-68序列。3.根据权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于：所述第一核基质结合区序列为人X-29MAR序列，GenBank：EF694970.1，第1～3337位碱基。4.根据权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于：所述筛选标记基因为新霉素磷酸转移酶基因或博来霉素抗性基因。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天云，林艳，井长勤，李琴，王建华，郭梦龙，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41