一种转基因斑马鱼的制备方法技术

一种转基因斑马鱼的制备方法，涉及基因工程。1)CYP1A启动子序列的改造；2)Tol2转座子系统敲入质粒的构建和显微注射样品的制备；3)斑马鱼胚胎的显微注射和继代培养。提供一种含有12个DRE的CYP1A启动子的构建方法，以及含有该启动子连接绿色荧光蛋白基因的重组Tol2转座子敲入质粒，质粒线性化纯化的方法和显微注射样品的配方。通过显微注射技术制备得到的Tg(pCYP1A‑6×DRE‑EGFP)和Tg(pCYP1A‑12×DRE‑EGFP)转基因斑马鱼，对比了含有6个DRE与12个DRE启动子的活性。

【技术实现步骤摘要】
一种转基因斑马鱼的制备方法
本专利技术涉及基因工程，尤其是涉及一种转基因斑马鱼的制备方法。
技术介绍
持久性有机污染物(persistentorganicpollutants,POPs)是指通过各种环境介质(大气、水、生物体等)能够长距离迁移并长期存在于环境，具有长期残留性、生物蓄积性、半挥发性和高毒性，对人类健康和环境具有严重危害的天然或人工合成的有机污染物质。二噁英类化合物(Dioxins)是一类典型的持久性有机污染物，长期存在于自然环境中并引起高度关注。该类化合物毒性极强，在自然环境中极难降解，能在全球范围内长距离迁移,被生物体摄入后不易分解，并沿着食物链逐级浓缩放大，对生物具有致癌、致畸、内分泌干扰等作用。二噁英类化合物是多氯二苯并对二噁英(polychlorinateddibenzodioxins,PCDDs)、多氯二苯并呋喃(polychlorinateddibenzofurans,PCDFs)和多氯联苯(polychlorinatedbiphenyls,PCBs)等一类多环芳烃的总称。其中被人们广泛关注的包括四氯二苯并对二噁英(Tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)、苯并芘(Benzoapyrene,BaP)、萘、蒽、菲等。该类化合物能与细胞内多环芳香烃化合物受体(ArylhydrocarbonReceptor,AhR)蛋白结合，发生作用，诱导下游基因表达，引发一系列生物学效应。而TCDD是这类污染物中与AhR结合能力最强的物质，即毒性最强的二噁英。本专利技术用TCDD作为标准物质，探究转基因斑马鱼在TCDD刺激下绿色荧光蛋白的表达情况。二噁英类化合物在生物体内作用的分子机制主要是通过激活芳香烃受体(AhR)信号通路而引起生物学效应。AhR是一个螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)转录因子家族的成员，并具有Per-Arnt-Sim(PAS)结构域，属于bHLH超家族的转录因子。它的分子量存在种属差异。AhR的配基主要包括卤代芳香烃类(Polycyclicaromatichydrocarbons,HAHs)和多环芳香烃类(Halogenatedaromatichydrocarbons,PAHs)化合物，主要是人工产生的外源性物质。近年来的研究发现，越来越多的天然化合物也能与AhR结合，说明AhR具有高度的配基多样性的特点。AhR执行功能时，需要和另一个bHLH家族成员ARNT形成异源二聚体，识别并结合靶基因。(MichaelS,AlessandroP,ScottR,etal.LigandbindingandactivationoftheAhreceptor[J].Chemico-BiologicalInteractions,2002,141:3-24)(Poland,A.Knutson,J.C.2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinandrelatedhalogenatedaromatichydrocarbons:examination-nofthemechanismoftoxicity[J].Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol,1982,22:517-542.)多数细胞质中的AhR未与配体结合处于静息复合物的状态，该复合物包括1个AhR、热激蛋白90(heatshockprotein90,HSP90)二聚体、乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白2(hepatitisBvirusXprotein-associatedprotein2,XAP2)以及一个p23辅伴侣蛋白分子结合。HSP90的结合使AhR维持一种非活化、可与配体结合的状态，它起到了稳定AhR的构象及抑制AhR与ARNT二聚化的作用；XAP2可以改变AhR被入核蛋白importinβ识别的能力，抑制AhR的泛素化降解。而AhR在细胞质中的定位与自身核输出信号(nuclearexportsignal,NES)有关，AhR序列中存在两个NES，分别位于bHLH和PAS域，非结合配体的AhR利用的是PAS域的NES，而结合配体的AhR利用的是bHLH域的NES。AhR功能的活化也会受到其结合蛋白以及其自身序列变化的调节。HSP90可以通过结合AhR的PASB和bHLH结构域而结合AhR，p23可以稳固这种结合。HSP90与AhR的结合有助于AhR形成配基高亲和力的构象。同时，HSP90可以将AhR的入核序列隐藏起来，从而使得静息态的AhR保持在细胞质内。而配基与AhR结合改变了AhR与HSP90的结合从而暴露其入核序列。XAP2可以与AhR和HSP90结合，这种结合不仅可以防止AhR的泛素化和蛋白水解，也有助于AhR驻留在细胞质内，当脂溶性很强的二噁英类化合物通过扩散作用穿过细胞膜进入细胞质时，与静息态的AhR蛋白复合体结合，AhR与其配基结合后构象发生变化，暴露了其位于N端的入核序列(Nuclearlocalizationsequence,NLS)，入核序列引导该复合物进入细胞核。入核后，AhR从复合物中解离出来，与细胞核内的ARNT形成异源二聚体，结合到靶基因的DNA生物异源物质效应元件(xenobiotic-responsiveelement,XRE，也称为DRE)上，启动下游基因(如：CYP1A)的转录。在AhR和ARNT形成二聚体识别并结合靶基因的XRE，并招募一系列激活因子。绝大多数AhR依赖基因的启动子上游都动发现了DRE序列，所以DRE可以作为判断一个基因是否受AhR调控的依据。细胞色素氧化酶P450(Cytochrome450,CYP450s)酶系是自然界中最具有催化活性的生物催化酶之一，它在生物体中具有重要的生理功能。CYP450s能对各种内源性物质(如类固醇、脂肪酸等)以及外源性物质(如TCDD、苯并(a)芘等)进行生物转化的第I相反应，促进这些酶在芳香烃类化合物代谢时的作用。目前，由于CYP450酶系同工酶活性对外源性物质的高敏感性，TCDD可以诱导CYP1A基因mRNA的表达，AhR激活CYP1A基因是通过与其启动子上的5’-TNGCGTG-3’，其中N为任意的核苷酸。(M.S.Denison,J.M.Fisher,andJ.P.Whitlock,Jr.,TheDNARecognitionSitefortheDioxin-AhReceptorComplex.NucleotideSequenceandFunctionalAnalysis,JBiolChem,1988,263:17221-4.)CYP1A表达量与二噁英暴露呈现正相关性，可以使其作为早期评估和检测水生生态环境系统污染的重要指标。近年来，CYP450在环境毒理学方面受到了越来越多的关注。因此，人们确定CYP1A为二噁英暴露的生物标志物，该基因上游因物种的不同而具有不同数目和位置的DRE序列，而CYP1A基因在RNA水平或蛋白水平表达量的高低也是二噁英暴露水平的标志之一。斑马鱼(Daniorerio)是一种典型的模式动物，优势非常突出，体长4～6cm，体呈纺锤形，背部橄榄色，体侧从鳃盖后直伸到尾有数条银蓝色纵纹，臀鳍部也有与体色相似的纵纹。斑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因斑马鱼的制备方法，其特征在于其具体步骤如下：1)CYP1A启动子序列的改造；2)Tol2转座子系统敲入质粒的构建和显微注射样品的制备；3)斑马鱼胚胎的显微注射和继代培养。

【技术特征摘要】
1.一种转基因斑马鱼的制备方法，其特征在于其具体步骤如下：1)CYP1A启动子序列的改造；2)Tol2转座子系统敲入质粒的构建和显微注射样品的制备；3)斑马鱼胚胎的显微注射和继代培养。2.如权利要求1所述一种转基因斑马鱼的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述CYP1A启动子序列的改造的具体方法如下：(1)含6个DRE的CYP1A启动子的改造；根据已知的斑马鱼基因组序列设计引物，在序列两端添加XhoI、HindⅢ两个酶切位点；采用常规分子克隆的方法和overlapPCR技术，克隆并改造得到含6个DRE的CYP1A启动子；改造后PGL6-TA-pCYP1A-6×DRE序列如下：(2)含12个DRE的CYP1A启动子的改造，具体方法如下：①选取斑马鱼CYP1A基因启动子中两个含有多DRE的区域，设计以下引物：12×DRE-1F：5’-CGCGGATCCAAGCCGAACAGGAGGGTA-3’(BamHI)12×DRE-1R：5’-AAAGATATCATTGCCTGCATGTTTGAG-3’(EcoRV)12×DRE-2F：5’-AAAGATATCCCTTTAATCAGGGGTCGCC-3’(EcoRV)12×DRE-2R：5’-CTAGTCTAGACCGGAGCGATCGAGTGGATA-3’(XbaI)以斑马鱼基因组DNA为模版分别进行普通PCR后，切胶回收得到序列12×DRE-1和序列12×DRE-2两段序列如下：序列12×DRE-1：序列12×DRE-2：②把序列12×DRE-1和序列12×DRE-2两段序列分别用限制酶(BamHI和EcoRV)与(EcoRV和XbaI)37℃酶切过夜后，切胶回收片段；同时用限制酶(BamHI和EcoRV)与(EcoRV和XbaI)对pCMV-C-EGFP质粒酶切并回收片段，最后用T4DNA连接酶将序列12×DRE-1和序列12×DRE-2两段序列与质粒连接，得到pCMV-C-pCYP1A-12×DRE-EGFP重组质粒；③以重组质粒pCMV-C-pCYP1A-12×DRE-EGFP为模版，设计引物12×DRE-F和12×DRE-R，进行PCR添加酶切位点，引物序列如下：12×DRE-F：5’-CGCCTCGAGAAGCCGAACAGGAGGGTA-3’(XhoI)12×DRE-R：5’-CTAGAAGCTTCCGGAGCGATCGAGTGGATA-3’(HindIII)切胶回收后得到含有12个DRE的启动子pCYP1A-12×DRE序列如下：3.如权利要求1所述一种转基因斑马鱼的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述Tol2转座子系统敲入质粒的构建和显微注射样品的制备的具体方法如下：(1)Tol2转座子敲入系统供体质粒的构建：用限制性核酸内切酶XhoI和HindIII对步骤1)中的PGL6-TA-pCYP1A-6×DRE重组质粒、pCYP1A-12×DRE片段进行酶切，再次电泳切胶回收；同时用XhoI和HindIII对Tol2转座子pT2AL200R150G质粒双酶切，大片段切胶回收，回收的Tol2转座子载体分别和pCYP1A-6×DRE、pCYP1A-12×DRE启动子片段混合，同T4DNA连接酶25℃连接1h；转化感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜，挑取单菌落于...

【专利技术属性】
技术研发人员：左正宏，沈超，周懿翕，王重刚，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35