一种基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体及其应用技术方案

本发明专利技术公开了基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体及其应用。其包括Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白和与其结合的特定基因的向导RNA，在Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白上具有SunTag系统，SunTag系统中含有GCN4抗原表位决定簇，将高亮度绿色荧光蛋白mNeonGreen连接在GCN4抗体上，GCN4抗体与GCN4抗原表位决定簇相结合。本发明专利技术的基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其荧光强度较强，能够在活细胞条件下观察特定基因的各个时期的表达情况，可以获得特定基因在整个间期和分裂期的动态变化趋势，并且不会将细胞杀死。

A carrier for mammalian cell genome localization based on CRISPRCas9 system and its application

The present invention discloses a carrier for mammalian cell genome localization based on CRISPRCas9 system and its application. The Cas9 protein mutant dCas9 protein and its binding wizard RNA specific gene, SunTag system in which the mutant of Cas9 protein and dCas9 protein, SunTag system containing GCN4 epitope determinant, the high brightness green fluorescent protein mNeonGreen connected to the GCN4 antibody, GCN4 antibody and GCN4 antigen epitope determinant combination. The carrier in vivo positioning of the mammalian genome based on the CRISPRCas9 system of the invention, the strong fluorescence intensity of each period to observe the expression of specific genes in living cells under the condition, can obtain certain genes in the dynamic change trend of the interphase and mitotic phase, and will not kill cells.

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体及其应用。
技术介绍
成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR/Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedsystems)，是目前最高效的基因组编辑系统。CRISPR/Cas系统总共有五大类，TypeⅡCRISPR-Cas系统在细胞和生物水平上的基因编辑方面已被广泛高效地运用，它由Cas9核蛋白和一条具有crRNA和tracrRNA功能的向导RNA构成。其中Cas9蛋白含有两个起切割目的序列作用的保守区域，分别为HNH和Ruvc结构域；而在向导RNA的3’端存在着crRNA:tracrRNA的支架，可巩固向导RNA和Cas9蛋白的相互作用。CRISPR/Cas9系统主要是通过识别特定基因序列后进行切割达到基因编辑的作用，故需要一条长度约为20个核苷酸的向导序列和一条含有PAM(protospaceradjacentmotif)DNA序列，不同菌种来源的Cas9蛋白识别的PAM不尽相同，对于StreptococcuspyogenesCas9(SpCas9)蛋白则是5’-NGG-3’。当具备上述所需结构，CRISPR/Cas9系统则可精确地进行基因编辑，首先Cas9蛋白与向导RNA形成复合物，然后通过识别特定基因的DNA序列的PAM，解旋DNA序列，接着向导RNA与单链DNA形成RNA-DNA复合结构，紧接着Cas9蛋白的HNH和Ruvc结构域各自切割特定DNA序列的一条链，形成带有平末端的DNA双链断裂，之后通过修复途径达到基因编辑的效果。(Jiang,W.,Bikard,D.,Cox,D.,Zhang,F.andMarraffini,L.A.(2013)RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems.Nat.Biotechnol.,31,233–239.)在此之后，科学家发现通过点突变可HNH和Ruvc结构域的活性沉默后并不会影响Cas9蛋白识别特定的DNA序列的功能，此时Cas9蛋白被称为nuclease-deadCas9(dCas9)蛋白，起到了靶向特定DNA序列的作用，研究人员利用这一特性实现了基因表达水平调控、染色质成像等功能。(Chen,B.etal.(2016)ExpandingtheCRISPRimagingtoolsetwithStaphylococcusaureusCas9forsimultaneousimagingofmultiplegenomicloci.NucleicAcidsRes,44,1-13.)若在dCas9蛋白尾部串连一个荧光蛋白，同时表达任意一个具有重复序列或非重复序列的特定DNA序列的向导RNA，通过CRISPR/Cas9系统的功能则可达到标记特定DNA序列的效果，此功能被称为CRISPR成像。CRISPR成像技术可以使得人们观察到活细胞中特定基因的动态变化，例如端粒的长度随着时间推移是如何改变的，特定基因的拷贝数在间期和分裂期是如何变化的。另外，了解一些基因组元件在活细胞中的精确定位对于认识染色体动力学至关重要，这是因为基因是根据它们在三维空间中的位置来控制我们的生物学和健康。一个基因要转录和表达，在染色体上它必须是可接近的。DNA在拥挤细胞核中的定位对从胚胎发育到癌症一切的事物均起重要的作用。然而，当前的一些技术最多只能在活细胞中一次追踪三个基因组位点。标记更多的位点要求通过用甲醛来浸泡细胞固定它们，因此这会杀死细胞，使得无法观察染色体结构响应刺激或随时间推移发生的改变。但CRISPR成像技术则可以在不杀死细胞的情况下达到三个及三个以上基因组位点，目前，最新研究表明可以同时标记七个基因位点。(Ma,H.etal.(2016)MultiplexedlabelingofgenomiclociwithdCas9andengineeredsgRNAsusingCRISPRainbow.Nat.Biotechnol.,34,528-531.)在CRISPR成像系统中的荧光蛋白多为sfGFP，它可以在重复序列较多的DNA序列情况下达到很好的标记效果，但荧光强度相对较弱，若用普通的荧光显微镜捕捉其标记基因的荧光信号，特别是捕捉sfGFP荧光蛋白标记重复序列很少的情况下难度系数比较大，只能通过串联数个荧光蛋白来增强起荧光信号，但这个方法却会使得基因标记的效率下降且噪音升高，并不能彻底解决荧光信号弱的问题。目前，尚未有荧光信号特别强的荧光蛋白应用于CRISPR成像系统中，若找到一种荧光强度较强的荧光蛋白应用于此系统中，相信可以更清晰明确的观测到特定基因各个时期的变化且可以探查细胞周期进程中、表观遗传调节过程中或响应细胞刺激过程中，染色体内和染色体间结构域动态相互作用。理论上，研究人员若应用这种方法，可绘制出每个人类染色体特有重复序列在染色体内的位置。原则上，这种方法也可用于分析核纤层相关的结构域和染色体捕获为基础的拓扑关联结构域，并允许科学家对活细胞中诸如易位和癌症相关染色体破碎、重排这种事件进行可视化研究。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体。本专利技术的基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其特征在于，包括Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白和与其结合的特定基因的向导RNA，在Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白上具有SunTag系统，SunTag系统中含有GCN4抗原表位决定簇，将高亮度绿色荧光蛋白mNeonGreen连接在GCN4抗体上，GCN4抗体与GCN4抗原表位决定簇相结合。优选，所述的基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其为环形载体，其核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二个目的是提供基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体在对哺乳动物细胞基因组进行活体定位中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的方法，其特征在于，将上述基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体通过脂质体介导转染到哺乳动物细胞中共培养，然后通过荧光显微镜观察。本专利技术通过Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白和特定基因的向导RNA结合后，在向导RNA引导下定位到特定基因，由于SunTag系统中含有24个GCN4抗原表位决定簇，高亮度绿色荧光蛋白m-NeonGreen连接在GCN4抗体上，即scFv-GCN4，故高亮度绿色荧光蛋白可以和SunTag系统结合，且SunTag系统是连接在dCas9蛋白后面的多肽，因此基于上述部分组成能够达到在特定基因上发光进而达到定位的效果。本专利技术的基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其荧光强度较强，能够在活细胞条件下观察特定基因的各个时期的表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其特征在于，包括Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白和与其结合的特定基因的向导RNA，在Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白上具有SunTag系统，SunTag系统中含有GCN4抗原表位决定簇，将高亮度绿色荧光蛋白mNeonGreen连接在GCN4抗体上，GCN4抗体与GCN4抗原表位决定簇相结合。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPRCas9系统对哺乳动物细胞基因组进行活体定位的载体，其特征在于，包括Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白和与其结合的特定基因的向导RNA，在Cas9蛋白的突变体dCas9蛋白上具有SunTag系统，SunTag系统中含有GCN4抗原表位决定簇，将高亮度绿色荧光蛋白mNeonGreen连接在GCN4抗体上，GCN4抗体与GCN4抗原表位决定簇相结合。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的基于CRISPRCas9系统...

【专利技术属性】
技术研发人员：荣知立，叶慧颖，林瑛，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44