一种基于固相连接CRISPR/Cas9gRNA串联表达载体构建新技术制造技术

本发明专利技术公开了一种基于固相连接的CRISPR/Cas9gRNA串联表达载体构建新技术,该技术使用链霉亲和素磁珠和biotin偶联的PCR起始片段、延伸片段和终止片段，通过精确设计的酶切位点，使每个片段能通过粘末端精确连接。经过酶切，清洗，连接的步骤的循环而将多个片段在短时间内高效连接多个gRNA表达载体构建技术。该技术能够将构建周期从15‑20天缩短到1天内完成，极大地节约成本和时间。

【技术实现步骤摘要】
一种基于固相连接CRISPR/Cas9gRNA串联表达载体构建新技术
本专利技术涉及一种基于固相连接的CRISPR/Cas9gRNA串联表达载体构建新技术，应用在CRISPR/Cas9介导的多gRNA表达载体在细胞及动物模型等基因组编辑技术中的应用。
技术介绍
CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)/Cas9技术是一种继锌指核酸酶(ZFN)和TALEN技术之后可用于精确修改基因组DNA的崭新的基因组编辑技术。其具有效率高、速℃快及简单经济的特点，在细胞及动物基础研究及实验模型的构建方面的应用前景都非常广阔[1]。目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR/spCas9系统和来自Staphylococcusaureus的CRISPR/saCas9应用最为广泛。Cas9蛋白含有核酸酶结构域，可以切割DNA双链。Cas9首先与guideRNA(gRNA)结合成复合物，然后通过PAM(ProtospacerAdjacentMotif)序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂[2,3。gRNA作为Cas9结合到目的DNA的关键识别序列,gRNA的设计决定了Cas9-gRNA复合体最终的切割效率。通常gRNA由聚合酶III型启动子如U6，H1转录获得成熟gRNA序列。然而单gRNA表达载体已经很难满足当前实验的需求，能快速、高效地构建同时表达多个gRNA的多gRNA表达载体的需求已经非常迫切。多gRNA表达载体的需求和优势主要体现在以下几个方面：1)筛选最优的目标DNA靶点，针对一个靶点通常需要设计3条或者3条以上的gRNA序列；2)用于筛选效率高的gRNA靶点，单gRNA表达载体需要构建3个或3个以上，周期长，实验繁琐；3)需要同一次针对多个目标DNA靶点；4)针对一个靶点同时使用多条gRNA，用以提高最终切割效率。对比单gRNA表达载体，多gRNA表达载体只需构建一次，通过测序同样可以筛选到最优的gRNA，同时可以提高导入效率，提高细胞或动物模型的阳性率。此外，目前主流方案都已经应用病毒技术表达Cas9及gRNA，多个载体意味着包装更多的病毒，经济成本和时间成本都会成倍增加。由此可见在单一载体同时表达多个gRNA将极大提高CRISPR/Cas9的应用空间，降低成本，提高效率。目前主要的多gRNA表达载体的构建方案为每次构建一个gRNA，分多次构建完成，这样包含3个gRNA的载体的整个构建周期长达15d以上。为了解决构建周期问题，有研究者采用了tRNA剪切的策略表达多个gRNA[4]，但是该方案操作复杂，并没有解决构建周期的根本问题，所以并没有得到广泛应用。本专利技术基于链霉亲和素磁珠的固相连接方法将构建3-4个gRNA到单载体的连接步骤缩短到1d内就可以完成，极大地提高了效率，节省了大量时间和经济成本。参考文献1.EstrelaR,CateJH.EnergybiotechnologyintheCRISPR-Cas9era.CurrOpinBiotechnol.2016Feb10；38:79-84.2.MaliP,YangL,EsveltKM,AachJ,GuellM,DiCarloJE,NorvilleJE,ChurchGM.RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science.2013Feb15；339(6121):823-6.3.CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuX,JiangW,MarraffiniLA,ZhangF.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science.2013Feb15；339(6121):819-23.4.XieK,MinkenbergB,YangY.BoostingCRISPR/Cas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem.ProcNatlAcadSciUSA.2015Mar17；112(11):3570-5。
技术实现思路
当前用于CRISPR/Cas9技术必需的多gRNA表达载体存在着构建复杂、周期长、成本高的缺点。主要原因在于当前的方法需要每一步构建后都要证实构建成功后才能进行下一步构建。构建能同时表达3个gRNA的多gRNA表达载体的周期在15d以上，构建表达4个gRNA的多gRNA表达载体的周期在20d以上。为解决上述技术问题，本专利技术采用固相连接的构建方法，无论是构建3个gRNA还是4个gRNA的多gRNA表达载体，都能在1个工作日内完成连接构建工作，极大地提高了构建效率。本专利技术的第一方面，使用链霉亲和素磁珠和biotin偶联的PCR起始片段、延伸片段和终止片段，通过精确设计的酶切位点，使每个片段能通过粘末端精确连接。经过酶切，清洗，连接的步骤的循环而将多个片段在短时间内高效连接的多gRNA表达载体构建方法。本专利技术第二方面,提供一种由gRNA-spacer-U6promoter模块组成的模板序列，其中，spCas9对应的模板含有SEQ.NO.1所示的碱基序列，saCas9对应的模板含有SEQ.NO.2所示的碱基序列。本专利技术第三方面,提供一种由含有SEQ.NO.3及SEQ.NO.4所示的碱基序列的引物用于PCR获得初始片段。本专利技术第四方面,提供一种由含有SEQ.NO.5、SEQ.NO.6和SEQ.NO.7所示的碱基序列。其中SEQ.NO.5或SEQ.NO.6引物可以根据要引入gRNA的数量设计多条。SEQ.NO.7配合根据SEQ.NO.5或SEQ.NO.6设计引物用于PCR获得延伸片段。本专利技术第五方面,提供一种由含有SEQ.NO.8所示的碱基序列配合根据SEQ.NO.5或SEQ.NO.6设计引物用于PCR获得终止片段。附图说明下面结合附图与具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。附图1:pcDNA3.1(+)载体附图2：普通真核多gRNA表达载体(HY-multi-gRNA-Express)附图3：腺病毒多gRNA表达载体(HY-multi-gRNA-ADV-Express)附图4：慢病毒多gRNA表达载体(HY-multi-gRNA-LV-Express)附图5：腺相关病毒多gRNA表达载体(HY-multi-gRNA-AAV-Express)附图6：各连接片段及载体片段电泳图附图7：使用固相连接方法构建的多gRNA过表达腺病毒载体图谱附图8：阳性克隆鉴定电泳图(1490bp)。具体实施方式以下涉及的化学试剂和生物制品，如未特别说明都为商业化产品。另外，其他未注明的实验操作按照常规分子生物学操作方法进行。实施例11.针对人基因PDCD1(基因ID5133)设计3条spCas9gRNA序列如下：gRNA靶点1：GCTCTCTTTGATCTGCGCCTTGG；gRNA靶点2:GTGTCACACAACTGCCCAACGGG；gRNA靶点3:GCTTGTCCGTCTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于固相连接CRISPR/Cas9gRNA串联表达载体构建新技术, 其特征在于：使用链霉亲和素磁珠和biotin偶联的PCR起始片段、延伸片段和终止片段，通过精确设计的酶切位点，使每个片段能通过粘末端精确连接；经过酶切，清洗，连接的步骤的循环而将多个片段在短时间内高效连接多个gRNA表达载体构建技术。

【技术特征摘要】
1.一种基于固相连接CRISPR/Cas9gRNA串联表达载体构建新技术,其特征在于：使用链霉亲和素磁珠和biotin偶联的PCR起始片段、延伸片段和终止片段，通过精确设计的酶切位点，使每个片段能通过粘末端精确连接；经过酶切，清洗，连接的步骤的循环而将多个片段在短时间内高效连接多个gRNA表达载体构建技术。2.根据权利要求1所述方法中使用的spCas9及saCas9模板序列：其特征在于：由gRNA-spacer-U6promoter模块组成的模板序列，其中，spCas9对应的模板含有SEQ.NO.1所示的碱基序列，saCas9对应的模板含有SEQ.NO.2所示的碱基序列。3.如权利要求1所述方法中使用PCR引物序列：其特征在于：所述引物序列为含有SEQ.NO.3及SEQ.NO.4所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨兴林，陈国泽，潘讴东，
申请(专利权)人：和元生物技术上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31