利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法技术方案

本发明专利技术提供利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法，针对玉米中的目标基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米中特定基因的定点突变。进一步地，通过遗传转化的方法将含有CRISPR/Cas9的载体转入携带目标基因的受体材料中，获得该目标基因定点突变的再生植株。利用本方法可实现对玉米基因组的定点突变，本方法具有实验周期短、操作简便等特点，利用不同靶向的CRISPR/Cas9系统可对不同目标基因进行定点定向改造，为玉米改良育种提供了新方法，对于改良玉米性状具有重大实际意义。

Method for spot mutation of maize gene by using CRISPR/Cas9 system

The present invention provides a method for maize gene mutation by CRISPR/Cas9 system, aiming at the design of target genes in Maize sgRNA sequence based on CRISPR/Cas9, which contains the sgRNA sequence encoding DNA fragment inserted into the vector carrying CRISPR/Cas in maize transformation, to achieve targeted to specific gene mutations in maize. Further, the CRISPR/Cas9 containing vector is transferred into recipient material carrying the target gene by genetic transformation, and a regenerated plant of the target gene site mutation is obtained. The method can achieve a fixed point of the maize genome mutation, this method has short experimental period, simple operation and other characteristics, the CRISPR/Cas9 system with different target of different target gene orientation transformation, provides a new method for the improvement of maize breeding, is of great practical significance for the improvement of maize traits.

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法
本专利技术涉及植物转基因
和作物遗传育种领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法。
技术介绍
随着生物技术的不断发展，越来越多的新型育种技术不断涌现。传统育种技术周期长，难以对目标形状作定点定向改良。近些年兴起的生物技术育种很大程度上缩短了育种周期，可有目的地引入新性状或改良固有性状。CRISPR(clusteredregularlyinterspersedshortpalindromicrepeats)/Cas是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统。它利用靶位点特异性的RNA指引Cas蛋白对靶位点序列进行修饰，进而在靶标序列上形成各种类型的突变。自2013年以来，CRISPR/Cas系统已经成功应用于人类、小鼠、斑马鱼、家蚕、果蝇、酵母、拟南芥及水稻、大豆等多个物种中。在医学上，该系统可用于某些疾病的治疗。在基础生物学领域，该方法可用于基因功能研究。近年来有学者开始应用该系统对作物内源基因进行改良，用于产生新的育种材料。CRISPR/Cas系统由于其可对靶标位点进行特异性改变而受到高度关注，且定点改变后的作物在第二代即可获得突变基因纯合体，大大缩短了育种周期。玉米是世界上最重要的粮食和饲料作物，目前尚未发现在玉米育种中应用CRISPR/Cas系统的报道。在玉米种质改良上应用该技术具有重要价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法。本专利技术的另一目的是提供上述方法在玉米基因定点突变育种中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法。为此，针对玉米中的目标基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米中特定基因的定点突变。本专利技术中所述玉米包括自交种、杂交种、普通玉米、甜玉米、糯玉米等。优选地，所述玉米为祥249自交系。本专利技术中涉及的目标基因可以是本领域技术人员感兴趣的基因或有生物学功能的任何DNA序列，包括玉米基因组中任何有生物学功能的基因或DNA序列，或者是希望定点改良的任何基因，例如GFP基因。针对玉米祥249自交系转基因植株中GFP基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，其中，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-ACCGGGGTGGTGCCCATCC-3’。前述的方法，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，构建得到载体Cas9-GFP-gRNA，用载体Cas9-GFP-gRNA转化玉米，实现对玉米GFP基因的定点突变/敲除。其中，载体Cas9-GFP-gRNA的全序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供所述方法在玉米基因定点突变育种中的应用。所述玉米包括但不限于祥249自交系。所述应用包括以下步骤：(1)将玉米的幼胚浸入携带CRISPR/Cas9和选择标记基因(例如CP4)的农杆菌菌液中侵染；(2)将幼胚移至共培养培养基上培养；(3)将幼胚移至愈伤诱导培养基上培养，诱导初级愈伤组织；(4)将初级愈伤组织移至筛选培养基上培养，诱导抗性愈伤组织，再转移到分化培养基上，分化形成再生幼苗；(5)再生幼苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米；(6)根据sgRNA作用位点的核苷酸序列设计引物，通过PCR法鉴定玉米植株突变位点。其中，所述共培养培养基的组成如下：1/2MS+蔗糖15-30g/L+葡萄糖8-15g/L+脯氨酸0.1-0.3g/L+盐酸硫胺素0.1-1.0mg/L+AgNO315-25μM+L-半胱氨酸100-300mg/L+2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)0.3-1.0mg/L+毒莠定0.8-3.0mg/L+KT(6-糠基氨基嘌呤)0.01-1mg/L+乙酰丁香酮100-300μM+植物凝胶3-8g/L；优选地，共培养培养基的组成如下：1/2MS+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+脯氨酸0.115g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO320μM+L-半胱氨酸200mg/L+2,4-D0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+KT0.01-1mg/L+乙酰丁香酮200μM+植物凝胶8g/L；所述愈伤诱导培养基的组成如下：MS+蔗糖15-30g/L+脯氨酸0.1-0.3g/L+盐酸硫胺素0.1-1.0mg/L+AgNO315-25μM+水解酪蛋白0.1-1.0g/L+2,4-D0.3-1.0mg/L+毒莠定0.8-3.0mg/L+KT0.01-1mg/L+特美汀100-300mg/L+植物凝胶3-8g/L；优选地，愈伤诱导培养基的组成如下：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO320μM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+KT0.01-1mg/L+特美汀200mg/L+植物凝胶8g/L；所述筛选培养基的组成如下：MS+蔗糖15-30g/L+脯氨酸0.1-0.3g/L+盐酸硫胺素0.1-1.0mg/L+AgNO315-25μM+水解酪蛋白0.1-1.0g/L+2,4-D0.3-1.0mg/L+毒莠定0.8-3.0mg/L+特美汀100-300mg/L+草甘膦100-300mg/L+植物凝胶3-8g/L；优选地，筛选培养基的组成如下：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO320μM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L+草甘膦200mg/L+植物凝胶8g/L；所述分化培养基包括分化培养基I和分化培养基II：MS+蔗糖15-30g/L+硫酸铜3-15μM+MES(2-吗啉乙磺酸)0.3-0.8g/L+6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.0-4.0mg/L+特美汀100-300mg/L+草甘膦3-15mg/L+植物凝胶3-8g/L；优选地，分化培养基I：MS+蔗糖20g/L+硫酸铜10μM+MES0.5g/L+6-BA3.5mg/L+特美汀200mg/L+草甘膦10mg/L+植物凝胶8g/L；分化培养基II：MS+蔗糖15-30g/L+硫酸铜3-15μM+MES0.3-0.8g/L+特美汀100-300mg/L+草甘膦3-15mg/L+植物凝胶3-8g/L；优选地，分化培养基II：MS+蔗糖20g/L+硫酸铜10μM+MES0.5g/L+特美汀200mg/L+草甘膦10mg/L+植物凝胶8g/L；所述生根培养基的组成如下：MS+蔗糖15-30g/L+MES0.3-0.8g/L+IBA(吲哚丁酸)0.1-0.3mg/L+植物凝胶3-8g/L；优选地，生根培养基的组成如下：MS+蔗糖20g/L+MES0.5g/L+IBA0.2mg/L+植物凝胶8g/L。前述的应用，步骤(1)中玉米的幼胚是从授粉后6-15天，待玉米幼胚长至0.5-2.0mm时，从玉米幼穗上剥取获得。前述的应用，步骤(1)中将玉米的幼胚浸入如下侵染液中侵染5-15分钟。其中，侵染液组成为：1/2MS+蔗糖40-本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法，其特征在于，针对玉米中的目标基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米中特定基因的定点突变。

【技术特征摘要】
1.利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法，其特征在于，针对玉米中的目标基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米中特定基因的定点突变。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述玉米包括自交种、杂交种、普通玉米、甜玉米、糯玉米；优选地，所述玉米为祥249自交系。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目标基因包括玉米基因组中任何有生物学功能的基因或DNA序列。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目标基因包括GFP；其sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-ACCGGGGTGGTGCCCATCC-3’。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用载体Cas9-GFP-gRNA转化玉米，载体Cas9-GFP-gRNA的全序列如SEQIDNO:2所示。6.权利要求1-5任一项所述方法在玉米基因定点突变育种中的应用，所述玉米包括祥249自交系。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)将玉米的幼胚浸入携带CRISPR/Cas9和选择标记基因的农杆菌菌液中侵染；优选地，所述选择标记基因为CP4；(2)将幼胚移至共培养培养基上培养；(3)将幼胚移至愈伤诱导培养基上培养，诱导初级愈伤组织；(4)将初级愈伤组织移至筛选培养基上培养，诱导抗性愈伤组织，再转移到分化培养基上，分化形成再生幼苗；(5)再生幼苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米；(6)根据sgRNA作用位点的核苷酸序列设计引物，通过PCR法鉴定玉米植株突变位点。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述共培养培养基的组成如下：1/2MS+蔗糖15-30g/L+葡萄糖8-15g/L+脯氨酸0.1-0.3g/L+盐酸硫胺素0.1-1.0mg/L+AgNO315-25μM+L-半胱氨酸100-300mg/L+2,4-D0.3-1.0mg/L+毒莠定0.8-3.0mg/L+KT0.01-1mg/L+乙酰丁香酮100-300μM+植物凝胶3-8g/L；优选地，共培养培养基的组成如下：1/2MS+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+脯氨酸0.115g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO320μM+L-半胱氨酸200mg/L+2,4-D0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+KT0.01-1mg/L+乙酰丁香酮200μM+植物凝胶8g/L；所述愈伤诱导培养基的组成如下：MS+蔗糖15-30g/L+脯氨酸0.1-0.3g/L+盐酸硫胺素0.1-1.0mg/L+AgNO315-25μM+水解酪蛋白0.1-1.0g/L+2,4-D0.3-1.0mg/L+毒莠定0.8-3.0mg/L+KT0.01-1mg/L+特美汀100-300mg/L+植物凝胶3-8g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡燕琳，杨桥，王文舒，许洁婷，唐通，黄磊，旷乐，左丹，汤益，周倩，周正剑，刘涛，章旺根，马崇烈，成雄鹰，
申请(专利权)人：中国种子集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11