用于培育转基因玉米的培养基及培养方法技术

本发明专利技术提供用于培育转基因玉米的培养基，包括共培养培养基、愈伤诱导培养基、筛选培养基、分化培养基和生根培养基，其中共培养培养基和愈伤诱导培养基中分别添加有终浓度为0.5‑1.0mg/L的NAA，0.005‑0.05mg/L的TDZ和/或0‑0.1mg/L的KT。本发明专利技术还提供转基因玉米的培养方法，以玉米幼胚为外植体，通过农杆菌转化的方法获得转基因玉米植株，为玉米遗传育种提供新的种质资源。本方法具有周期短、阳性率高、操作简单的特点，为实现商业化大规模生产转基因玉米提供了新的方法。

Culture medium for culturing transgenic corn and culture method

The invention provides a culture medium for cultivation of transgenic maize, including culture medium, callus induction medium and rooting culture medium screening culture medium, differentiation medium and co culture, the induction medium were added to a final concentration of 0.5 1.0mg/L NAA medium and callus culture, 0.005 0.05mg/L / TDZ and 0 or 0.1mg/L KT. The invention also provides a method for culturing transgenic corn. The corn immature embryo is used as an explant, and the transgenic corn plants are obtained by the transformation of Agrobacterium tumefaciens, thereby providing a new germplasm resource for the corn genetic breeding. The method has the advantages of short cycle, high positive rate and simple operation, and provides a new method for realizing commercial large-scale production of genetically modified maize.

【技术实现步骤摘要】
用于培育转基因玉米的培养基及培养方法
本专利技术涉及植物转基因
和作物遗传育种领域，具体地说，涉及用于培育转基因玉米的培养基及培养方法。
技术介绍
玉米是我国重要的粮食作物和饲料作物，在我国粮食生产和国民经济中占有重要地位。然而自2010年以来，我国已从玉米净出口国转变为净进口国。2012年我国进口玉米521万吨，价值17亿美元。因此，通过育种技术的应用提高玉米产量，掌握玉米产业主动权是保持国内玉米供需平衡的关键，也将对我国粮食安全和应对可能出现的粮食危机产生深远影响。随着生物技术的不断发展，越来越多优于传统育种技术的新型育种技术不断涌现。传统育种技术周期长，需要不断地回交才能获得纯合后代。生物技术育种很大程度上缩短了育种周期，因而得到了较快发展，转基因育种便是其中的一种。在转化方法方面，除了基因枪法，还包括电击法、超声波法、微注射法、PEG法和农杆菌介导法。农杆菌介导法操作简单，转化率较高，费用低，且导入的外源基因多为单拷贝，是目前应用最为广泛的转化方法。在玉米转基因技术上，直到80年代后期才在遗传转化方面取得突破。1975年第一例玉米自交系(A188)转化再生植株见于报道。1988年，Klein等人以玉米的胚状体和非胚状体细胞为外植体，用基因枪法转移cat基因，观察到瞬时表达。农杆菌介导法直到1996年才成功用于转化玉米自交系A188。除了转化方法的限制，基因型也是限制玉米遗传转化发展的重要因素。因此，开发适合商业化生产的玉米品种的高效稳定的转基因方法，对于掌握转基因玉米产业主动权具有至关重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于培育转基因玉米的培养基及培养方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的用于培育转基因玉米的培养基组合，包括共培养培养基、愈伤诱导培养基、筛选培养基、分化培养基和生根培养基；其中，所述共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加NAA(萘乙酸)、TDZ(噻二唑苯基脲)和/或KT(6-糠基氨基嘌呤)，它们的终浓度分别为0.5-1.0mg/L、0.005-0.05mg/L、0-0.1mg/L；优选地，TDZ和NAA终浓度分别为0.005mg/L和0.5mg/L，KT的终浓度为0.1mg/L。所述筛选培养基中添加有草丁膦，其终浓度为5-200mg/L，优选10-40mg/L，更优选20mg/L。所述共培养培养基的组成如下：MS盐0.8-1.2g/L+N6盐0.8-1.5g/L+蔗糖15-30g/L+葡萄糖5-15g/L+脯氨酸0.1-0.3g/L+盐酸硫胺素0.1-1mg/L+AgNO3(硝酸银)10-20μM+L-半胱氨酸100-500mg/L+2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)1-1.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+TDZ0.005-0.05mg/L和/或KT0-0.1mg/L+乙酰丁香酮100-500μM+MES(2-吗啉乙磺酸)0.5-1g/L+1000×MS维生素1mL/L+植物凝胶6-10g/L。所述愈伤诱导培养基的组成如下：MS盐1.6-2.4g/L+N6盐1.6-3g/L+蔗糖20-40g/L+脯氨酸1-2g/L+MES0.5-1g/L+1000×MS维生素1mL/L+AgNO310-20μM+水解酪蛋白0.3-1.0g/L+2,4-D1-1.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+TDZ0.005-0.05mg/L和/或KT0-0.1mg/L+特美汀100-300mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。所述筛选培养基的组成如下：MS盐1.6-2.4g/L+N6盐1.6-3g/L+蔗糖20-40g/L+脯氨酸1.0-2.0g/L+1000×MS维生素1mL/L+AgNO310-20μM+水解酪蛋白0.3-1.0g/L+2,4-D1.0-1.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+MES0.5-1.0g/L+特美汀100-300mg/L+草丁膦5-200mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。所述分化培养基包括分化培养基I和分化培养基II，它们的组成如下：分化培养基I：MS盐4-5g/L+蔗糖20-30g/L+1000×LS维生素1mL/L+硫酸铜5-15μM+MES0.5-1.0g/L+6-BA(6-苄氨基嘌呤)2-4mg/L+特美汀100-300mg/L+双丙氨膦2-5mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L；分化培养基II：MS盐4-5g/L+蔗糖20-30g/L+1000×LS维生素1mL/L+硫酸铜5-15μM+MES0.5-1.0g/L+特美汀100-300mg/L+双丙氨膦2-5mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。所述生根培养基的组成如下：MS盐4-5g/L+蔗糖20-30g/L+MES0.5-1.0g/L+IBA(吲哚丁酸)0.1-0.5mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。其中，MS盐的组成如下：N6盐的组成如下：本专利技术还提供上述培养基组合在转基因玉米遗传育种中的应用。本专利技术进一步提供转基因玉米的培养方法，包括以下步骤：(1)将玉米的幼胚浸入携带目的基因和Bar标记基因的农杆菌菌液中侵染；(2)将幼胚移至所述共培养培养基上培养；(3)将幼胚移至所述愈伤诱导培养基上培养，诱导初级愈伤组织；(4)将初级愈伤组织移至所述筛选培养基上培养，诱导抗性愈伤组织，再转移到所述分化培养基上，分化形成再生幼苗；(5)再生幼苗在所述生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米。前述的方法，步骤(1)中玉米的幼胚是从授粉后6-15天，待玉米幼胚长至0.5-2.0mm时，从玉米幼穗上剥取获得。即，将玉米幼穗进行灭菌后剥取0.5-2.0mm长的幼胚，将幼胚浸入如下侵染液中侵染，侵染时间不超过15min(5-15min)。侵染液组成为：MS盐1.5-2.5g/L+蔗糖60-80g/L+葡萄糖20-40g/L+L-脯氨酸0.1-0.3g/L+乙酰丁香酮100-500μM+OD600值0.1-0.5(优选OD600值0.3)携带目的基因和Bar标记基因的农杆菌菌液。优选使用农杆菌菌株为EHA105。步骤(2)中培养条件为：23℃黑暗培养48-96h。步骤(3)中培养条件为：26-34℃黑暗培养1-2周。所述步骤(4)具体为：将初级愈伤组织移至所述筛选培养基上培养，培养条件为：28℃黑暗培养4-6周，诱导抗性愈伤组织，再转移到所述分化培养基I上，培养条件为：25℃，5000lx，光照培养1周，然后转移到所述分化培养基II上，培养条件为：25℃，5000lx，光照培养2周，分化形成再生幼苗。本专利技术还提供利用上述方法获得的转化玉米细胞、植株部分和转基因植株。本专利技术中涉及的玉米品种包括但不限于玉米自交系AY63。AY63为玉米品种安玉2166的母本，安玉2166以其丰产稳产性好、品质优、适应性广、抗倒伏，抗丝黑穗病，高抗茎腐病、穗粒腐病和大小斑病等特点得到大面积推广种植。以自交系AY63作为受体材料，建立组织培养体系，通过转化导入外源基因，可加快大穗型玉米品种育种进程，具有较大的商业价值，同时可为玉米育种提供新的种质资源。利用本专利技术提供的培养基和培养方法，以玉米幼胚为外植体，通过将外源基因成功地转入玉米组织中，可实现对玉米的高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化，转本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于培育转基因玉米的培养基组合，其特征在于，包括共培养培养基、愈伤诱导培养基、筛选培养基、分化培养基和生根培养基；所述共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加有NAA、TDZ和/或KT，它们的终浓度分别为0.5‑1.0mg/L、0.005‑0.05mg/L、0‑0.1mg/L；优选地，TDZ和NAA终浓度分别为0.005mg/L和0.5mg/L，KT的终浓度为0.1mg/L。

【技术特征摘要】
1.用于培育转基因玉米的培养基组合，其特征在于，包括共培养培养基、愈伤诱导培养基、筛选培养基、分化培养基和生根培养基；所述共培养培养基和愈伤诱导培养基中添加有NAA、TDZ和/或KT，它们的终浓度分别为0.5-1.0mg/L、0.005-0.05mg/L、0-0.1mg/L；优选地，TDZ和NAA终浓度分别为0.005mg/L和0.5mg/L，KT的终浓度为0.1mg/L。2.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述筛选培养基中添加有草丁膦，其终浓度为5-200mg/L，优选10-40mg/L，更优选20mg/L。3.根据权利要求1或2所述的培养基组合，其特征在于，所述共培养培养基的组成如下：MS盐0.8-1.2g/L+N6盐0.8-1.5g/L+蔗糖15-30g/L+葡萄糖5-15g/L+脯氨酸0.1-0.3g/L+盐酸硫胺素0.1-1.0mg/L+AgNO310-20μM+L-半胱氨酸100-500mg/L+2,4-D1.0-1.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+TDZ0.005-0.05mg/L和/或KT0-0.1mg/L+乙酰丁香酮100-500μM+MES0.5-1.0g/L+1000×MS维生素1mL/L+植物凝胶6-10g/L。4.根据权利要求1或2所述的培养基组合，其特征在于，所述愈伤诱导培养基的组成如下：MS盐1.6-2.4g/L+N6盐1.6-3g/L+蔗糖20-40g/L+脯氨酸1-2g/L+MES0.5-1g/L+1000×MS维生素1mL/L+AgNO310-20μM+水解酪蛋白0.3-1.0g/L+2,4-D1.0-1.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+TDZ0.005-0.05mg/L和/或KT0-0.1mg/L+特美汀100-300mg/L+植物凝胶2.5-3.5g/L。5.根据权利要求1或2所述的培养基组合，其特征在于，所述筛选培养基的组成如下：MS盐1.6-2.4g/L+N6盐1.6-3g/L+蔗糖20-40g/L+脯氨酸1-2g/L+1000×MS维生素1mL/L+AgNO310-20μM+水解酪蛋白0.3-1.0g/L+2,4-D1.0-1.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L+MES0.5-1.0g/L+特美汀100-300mg/L+草丁膦5-200m...

【专利技术属性】
技术研发人员：许洁婷，周倩，杨桥，魏楚楚，胡燕琳，黄磊，旷乐，左丹，汤益，杨晓凤，何实，涂年影，王萍，成雄鹰，章旺根，
申请(专利权)人：中国种子集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11