一种提高小麦加工品质的方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域，通过引入ω‑黑麦碱干扰基因使小麦中的ω‑醇溶蛋白基因和ω‑黑麦碱基因沉默，从中筛选出加工品质大幅度提高的小麦品系。该方法包括构建含“小麦Bx7基因启动子‑ω黑麦碱基因干扰片段‑水稻Wx终止子”表达盒的表达载体，然后经基因枪或农杆菌介导把所述表达盒转入小麦幼胚或幼胚愈伤组织中，最后经抗性筛选从再生的转基因小麦后代中筛选出加工品质大幅度提高的小麦新品系。通过本发明专利技术方法获得的转基因株系的沉降值和稳定时间显著提高，其中两个株系的稳定时间提高到了16‑20分钟，已达一等强筋麦水平（≥10分钟），应用前景十分广阔。

Method for improving processing quality of Wheat

The invention belongs to the field of plant gene engineering, through the introduction of Omega secalin interference gene in wheat gliadin gene omega and omega secalin gene silencing, screened wheat processing quality greatly improved from. The method includes the steps of constructing \wheat Bx7 gene promoter Omega secalin gene fragment interference rice expression vector Wx terminator\ box, and then by gene gun or Agrobacterium mediated the expression cassette into wheat immature embryos and immature embryo callus, finally selected wheat processing quality increase from transgenic wheat progeny regenerated by resistance screening. Obtained by the present method of transgenic lines sedimentation value and stability time increased, the stability time of two lines increased to 16 20 minutes, has reached a level of strong gluten wheat (over 10 minutes), very broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种提高小麦加工品质的方法
本专利技术属于植物基因工程领域，是通过引入ω-黑麦碱干扰基因使小麦中的ω-醇溶蛋白基因沉默或ω-醇溶蛋白基因与ω-黑麦碱基因均沉默，从中筛选出加工品质大幅度提高的小麦品系。
技术介绍
小麦1B/1R易位系由于具有高产和适应性广等优点，目前在我国的小麦生产中被广泛应用，但这类品种加工品质往往比较差。研究发现，小麦1B/1R易位系1RS染色体臂上的ω-黑麦碱基因被认为是导致面团加工品质差的重要原因，因此消除ω-黑麦碱基因的不良影响是改善小麦1B/1R易位系加工品质的一条重要途径。ω-黑麦碱基因是一个包括多个成员的基因家族，不同家族成员之间DNA序列高度相似，适合用RNA干扰技术进行沉默。专利技术人曾利用组成型Ubiquitin基因启动子驱动ω-黑麦碱基因干扰片段的表达实现了小麦1B/1R易位系中ω-黑麦碱基因的部分沉默，转基因株系的沉降值和稳定时间显著提高，但幅度比较有限。除ω-黑麦碱基因以外，小麦中的ω-醇溶蛋白基因对小麦的加工品质也有显著的不良影响，Waga和Skoczowski用常规育种技术创造了一些ω-醇溶蛋白全部缺失的小麦材料，发现其SDS沉降值显著提高；Blechl等报道了用RNA干扰沉默小麦1B/1R易位系中ω-黑麦碱基因的研究，表达载体中使用的启动子为小麦种子特异型高分子量麦谷蛋白10亚基基因的启动子，在详细分析的2个转基因株系中，ω-黑麦碱基因和ω-醇溶蛋白基因均被有效沉默，理论上SDS沉降值应显著提高，但实际上SDS沉降值并没有提高，可能还有一些其它因素在发挥作用。用表达水平更高的小麦种子特异型启动子驱动ω-黑麦碱干扰基因的表达，加工品质能否大幅度提高有待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用ω-黑麦碱干扰基因提高小麦加工品质的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供的利用ω-黑麦碱干扰基因提高小麦加工品质的方法，其特征在于向小麦中转入ω-黑麦碱干扰基因表达盒，然后从ω-醇溶蛋白基因高度沉默的转基因株系中或ω-醇溶蛋白基因与ω-黑麦碱基因均高度沉默的转基因株系中筛选出加工品质大幅度提高的小麦新品系。所述的ω-黑麦碱干扰基因表达盒，其由小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因（Bx7）启动子、ω-黑麦碱基因干扰片段和水稻Waxy基因(Wx)终止子依次连接组成。所述的向小麦中转入ω-黑麦碱干扰基因表达盒，采用基因枪介导或农杆菌介导的方法进行。所述的基因枪介导，是把ω-黑麦碱干扰基因表达盒和含BAR基因的表达盒混合后进行基因枪共转化。所述的农杆菌介导，是用含ω-黑麦碱干扰基因表达盒和含BAR基因表达盒的双T表达载体进行农杆菌转化。所述的向小麦中转入ω-黑麦碱干扰基因表达盒，其特征还在于用基因枪介导或农杆菌介导的方法把所述的ω-黑麦碱干扰基因表达盒导入到小麦幼胚或幼胚愈伤组织中，抗性再生后代经PCR检测和种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）检测，筛选得到ω-醇溶蛋白基因高度沉默的转基因株系或ω-醇溶蛋白基因与ω-黑麦碱基因均高度沉默的转基因株系，然后再经过进一步的加工品质检测，最后筛选出加工品质大幅度提高的转基因株系。本专利技术在提高小麦尤其是1B/1R易位系小麦加工品质方面有广泛应用前景。所述小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因启动子的PCR扩增引物对具有如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列。所述水稻Waxy基因终止子的PCR扩增引物对具有如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示序列。本专利技术的优点和有益效果：用本专利技术的方法对1B/1R易位系小麦科农199进行了品质改良，在得到的7个ω-醇溶蛋白基因与ω-黑麦碱基因均高度沉默的转基因株系中，有4个株系沉降值和稳定时间显著提高，其中两个株系的稳定时间提高到了16-20分钟，已达一等强筋麦水平（≥10分钟），而受体品种科农199的稳定时间仅为3.6-5.5分钟，说明本方法在大幅度提高小麦加工品质方面有巨大应用前景。附图说明图1是用A-PAGE电泳对10个纯合转基因株系进行的ω-醇溶蛋白基因和ω-黑麦碱基因表达情况的检测。图中CK为受体品种科农199，A为10个纯合的转基因株系。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步阐述。具体实施方式实施例1.小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因启动子和水稻Waxy基因终止子的克隆根据NCBI数据库中小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因启动子的序列（序列号DQ119142.1）设计PCR扩增引物对，Bx7-f1:acgtaagctttggaggccagggaaagacaatg（黑体部分为添加的HindIII酶切位点,Bx7-r1:actccccgggctgtcagtgaattgatctgtag（黑体部分为添加的SmaI酶切位点），扩增区段为翻译起始密码子ATP上游-10bp至-970bp，长度为961bp。以小麦品种藁城8901的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增选用保真性好的PfuTaq酶，扩增参数为：94℃5min分钟，94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环，72℃7min；根据NCBI数据库中水稻Waxy基因终止子的序列（序列号X53694.1）设计PCR扩增引物对，WxT-f1:tgaagagctcgagatctacatatggagtgat（黑体部分为添加的SacI酶切位点,WxT-r1:tagtgaattcgtatccactccctccgtcacat（黑体部分为添加的EcoRI酶切位点）,扩增区段为终止密码子TGA下游8-798bp,长度791bp，以水稻品种中花3号的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增的退火温度为56℃，其它扩增参数与扩增小麦启动子相同。2种PCR产物纯化后进行克隆测序,从中各选出1个分别与NCBI数据库中序列号为DQ119142.1和X53694.1序列一致的克隆用于下一步的载体构建。实施例2.种子特异型ω-黑麦碱基因沉默表达载体的构建在我们以前的专利中已构建了由组成型Ubi启动子驱动的ω-黑麦碱基因沉默表达载体pAHC25-Sec（ZL201010532880.9），其中的黑麦碱基因RNA干扰片段“正向黑麦碱片段-内含子片段-反向黑麦碱片段”（936bp）两端的酶切位点分别为SmaI和SacI。为构建种子特异型黑麦碱基因沉默表达载体，首先以pAHC15（ChristensenAH和QuailPH,TransgenicResearch,1996,5:213-218）做基础表达载体，依次通过HindIII/SmaI、SmaI/SacI和SacI/EcoRI双酶切，分别把pAHC15中的Ubi启动子、Gus基因和Nos终止子换成小麦的Bx7启动子、黑麦碱基因RNA干扰片段和水稻的Wax终止子，得到过渡性种子特异型ω-黑麦碱基因沉默表达载体pAHC15-Bx7-Sec-Wx。该表达载体用HindIII/EcoRI双酶切后得到的沉默黑麦碱基因的线性表达盒片段Bx7-Sec-Wx与剩下的载体片段大小相近，均为3kb左右，进一步用HindIII/EcoRI双酶切上述过渡性载体，酶切片段纯合后用PCR在72℃延伸10min的方法补平粘性末端，之后将其克隆到pEASY-T5Zero载体上(载体大小约4kb，由北京全式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高小麦加工品质的方法，其特征在于，向小麦中转入ω‑黑麦碱干扰基因表达盒，然后从ω‑醇溶蛋白基因沉默的转基因株系中或ω‑醇溶蛋白基因和ω‑黑麦碱基因均沉默的转基因株系中筛选出加工品质提高的小麦新品系。

【技术特征摘要】
1.一种提高小麦加工品质的方法，其特征在于，向小麦中转入ω-黑麦碱干扰基因表达盒，然后从ω-醇溶蛋白基因沉默的转基因株系中或ω-醇溶蛋白基因和ω-黑麦碱基因均沉默的转基因株系中筛选出加工品质提高的小麦新品系。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的ω-黑麦碱干扰基因表达盒由小麦高分子量麦谷蛋白7亚基基因启动子、ω-黑麦碱基因干扰片段和水稻Waxy基因终止子依次连接组成。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用基因枪介导或农杆菌介导的方法向小麦中转入ω-黑麦碱干扰基因表达盒。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用基因枪介导或农杆菌介导的方法把所述的ω-黑麦碱干扰基因表达盒导入到小麦幼胚或幼胚愈伤组织中，抗性再生后代经PCR检测和种子醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选得到ω-醇溶蛋白基...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴建芳，王海波，赵和，吕孟雨，董福双，刘永伟，周硕，杨帆，马秀英，
申请(专利权)人：河北省农林科学院遗传生理研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13