一种用于检测沙门氏菌的LAMP检测用引物组及检测方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，涉及一种用于检测沙门氏菌的LAMP检测用引物组，LAMP检测引物组包括四条特异性引物，分别为正向内侧引物FIP:SEQ ID NO.1、反向内侧引物BIP:SEQ ID NO.2、正向外侧引物F3:SEQ ID NO.3和反向内侧引物B3:SEQ ID NO.4。检测方法包括：1、提取待测样品DNA；2、配制LAMP检测反应体系；3、以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，用实时浊度法鉴定扩增结果。本发明专利技术对沙门氏菌定性检测灵敏度可达到6.13×10

Primer set for detecting LAMP of Salmonella and detection method thereof

The invention belongs to the technical field of biological detection, which relates to a group of primers for LAMP detection of Salmonella detection, LAMP detection primer group includes four specific primers, respectively. FIP:SEQ ID forward inner primer NO.1, reverse primer BIP:SEQ ID NO.2 medial, lateral forward primer F3:SEQ ID NO.3 and the reverse primer B3:SEQ ID NO.4 inside. The detection methods include: 1. Extracting samples to be tested; DNA; 2, preparing LAMP detection reaction system; 3, using DNA extracted from step 1 as template, performing LAMP amplification reaction, and using real-time turbidimetric method to identify amplification results. The sensitivity of the qualitative detection of Salmonella can reach 6.13 * 10

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测沙门氏菌的LAMP检测用引物组及检测方法
：本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种用于检测沙门氏菌的LAMP检测用引物组及检测方法。
技术介绍
：食品安全是各国都关注的重大问题，全球经济快速发展，人们的物质生活逐渐提高，动物源性食品的消费量也随之增加，随之而来的，是步入人们的视野，愈发受到人们关注的由动物源性食品引发的食品安全问题。根据国家食源性疾病监测网络显示的统计数据，食源性致病菌是食源性疾病的主要原因之一。动物源性食品中，细菌性食物中毒是最常见的。沙门氏菌是肠杆菌科中的一个重要菌属，是人和动物的常见病原菌，可引起人类多种疾病，如食物中毒、胃肠炎、菌血症、肠热症等。据统计，目前世界上85％的食物中毒是由沙门氏菌引起的，是居于前列的。目前，对沙门氏菌的生化实验检测和血清学鉴定等传统检测方法，需要较长的实验周期，试剂多而且杂，在快速、特异检测方面具有一定的局限性，而各种检测方法敏感、快速，却需昂贵庞大的仪器设备、复杂繁琐的电泳过程等，进而使检测在受到条件限制的检验工作中，很难得到普遍应用。因此，发展操作简便、快速准确、易推广的检测方法对霍乱疫情的监测与控制具有重要意义。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是Notomi等人在2000年专利技术的一种新的恒温核酸扩增技术。传统的PCR技术离不开反复升降温这个耗时耗能的过程，且反应程序设定也较繁琐。相比之下，LAMP技术克服了这些问题。根据LAMP技术的原理，它可实现在恒温条件下(一般在60～65℃)快速连续扩增，实现了实验过程快速、简便，仪器设备简单、便携，检测结果特异性强、灵敏度高的优点。LAMP扩增结果观察方式多，凝胶成像系统观察结果、肉眼观察颜色变化及试纸条技术，也可使用实时荧光法和实时浊度法，通过实时荧光PCR仪或实时浊度仪对扩增结果进行实时观察。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供快速、特异性好、灵敏度高的沙门氏菌的LAMP检测方法的引物组；本专利技术的另一个目的是提供一种沙门氏菌的LAMP检测方法。一种用于检测沙门氏菌的LAMP检测用引物组及检测方法，由内引物对FIP/BIP和外引物对F3/B3组成，FIP、BIP、F3、B3具体如下：一种利用前述引物组检测沙门氏菌的LAMP检测方法，包括以下步骤：步骤1、提取待测样品DNA；步骤2、配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4；步骤3、以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，用实时浊度法鉴定扩增结果。优选的，LAMP检测反应体系具体为：2×反应液RM12～13uL，FIP、BIP各3.7～4.3uL，F3、B3各0.4～0.6uL，BstDNA聚合酶0.9～1.2uL，待测样品DNA1.8～2.2uL，补超纯水至25uL。优选的，FIP、BIP的浓度是40umol/L，F3、B3的浓度是5umol/L。优选的，LAMP扩增反应的反应前的预热温度50.0℃，LAMP扩增反应的反应温度为64.0℃且进行40min，LAMP扩增反应的反应后的酶失活温度95℃进行2min。上述的LAMP检测方法中，检测结果通过实时浊度仪实时测量浊度值来判断核酸有无扩增。本专利技术采用上述技术方案，根据沙门氏菌基因hut的序列，设计4条特异性LAMP引物，用来建立沙门氏菌LAMP检测方法，结果表明，建立的LAMP检测方法对沙门氏菌的检测特异性良好，且方法的灵敏度高。本专利技术方法不受培养条件的限制，可在50min内完成核酸的检测。本专利技术对沙门氏菌定性检测灵敏度可达到6.13×102CFU/mL，优于一般PCR检测方法，其检测灵敏度是普通PCR的10倍。附图说明：附图1是LAMP引物筛选试验图，NO.1-5分别为空白对照、invE引物组、hilA引物组、invA引物组、hut引物组。附图2是60℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图3是61℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图4是62℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图5是63℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图6是64℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图7是65℃时温度对LAMP反应的影响试验图。附图8是30min时时间对LAMP反应的影响试验图。附图9是40min时时间对LAMP反应的影响试验图。附图10是50min时时间对LAMP反应的影响试验图。附图11是60min时时间对LAMP反应的影响试验图。附图12是引物特异性鉴定试验图，NO.2-8依次为甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌分离株DZJ-YS-001、沙门氏菌分离株DZJ-YS-002、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌扩增曲线图；Left反应槽的NO.1和Right反应槽的NO.9均为空白对照。附图13是是引物特异性鉴定试验图，NO.10-16依次为阪崎杆菌，沙门氏菌、肠出血行大肠杆菌O157:H7、致病性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠杆菌、单增李斯特菌、鲍氏志贺菌扩增曲线图；Left反应槽的NO.1和Right反应槽的NO.9均为空白对照。附图14是LAMP反应灵敏度试验图，NO.1为空白对照，NO.2-8分别是菌液浓度为6.13×108、107、106、105、104、103、102CFU/ml。附图15是LAMP反应灵敏度试验图，NO.9为空白对照，NO.10是菌液浓度为10CFU/ml。附图16是普通PCR反应灵敏度试验图，M为DL1000Marker，泳道1-8分别是菌液浓度为6.13×108、107、106、105、104、103、102、10CFU/ml。具体实施方式：以下叙述中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。一、引物设计按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中的沙门氏菌特异基因组序列，进行多序列比对，寻找一段高度保守区作为扩增对象，然后通过分子生物学软件LAMPDDesigner5设计4组引物，采用HPLC纯化方式。合成后的引物用超纯水稀释成100pmol/pL溶液，-20℃保存备用。各引物序列见表1。表1沙门氏菌的LAMP检测用引物二、沙门氏菌的LAMP检测标准方法的建立细菌基因组DNA快速抽提试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，LAMP扩增体系的2×反应液RM、BstDNA聚合酶为荣研生物科技(中国)有限公司产品。日本荣研LT-16alpha恒温扩增基因检测系统，ABIVeriti96WellThermalCycler核酸扩增仪、BioradGelDocXR凝胶成像系统。沙门氏菌实验用标准菌株购自中国工业微生物保存中心和北京路桥技术股份有限公司(见表2)。表2实验用菌种名称及编号1、样品DNA的提取样品为霍乱弧菌、EHECO157:H7、致病性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠杆菌、单增李斯特菌、痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏志贺菌、阪崎杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌分离株DZJ-YS-001、沙门氏菌分离株DZJ-YS-00212株标准菌株和2株沙门氏菌分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测沙门氏菌的LAMP检测用引物组及检测方法，其特征在于，由内引物对FIP/BIP和外引物对F3/B3组成，FIP、BIP、F3、B3具体如下：

【技术特征摘要】
1.一种用于检测沙门氏菌的LAMP检测用引物组及检测方法，其特征在于，由内引物对FIP/BIP和外引物对F3/B3组成，FIP、BIP、F3、B3具体如下：2.一种利用权利要求1所述的引物组检测沙门氏菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、提取待测样品DNA；步骤2、配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4；步骤3、以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，用实时浊度法鉴定扩增结果。3.如权利要求2所述的一种利用权利要求1所述的引物组检测沙门氏菌的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP检测反应体系具体为...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝俊虎，李萍，王芳焕，李婧，薛强，
申请(专利权)人：宁夏出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，中检国研北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏,64