一种与猕猴桃总酸含量性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与猕猴桃总酸含量性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用，根据该分子标记设计的引物为正向引物TA‑F为5’‑GTAAATGCATGGTAAAGAGGTCC‑3’，反向引物TA‑R为5’‑AGGAGAAAGGGAAAATAAAACGC‑3’。本发明专利技术首次定位了猕猴桃中控制总酸的主效QTL位点，可解释21.75%的表型方差，通过检测与总酸含量相关的分子标记，即可预测猕猴桃总酸含量，进而准确快速筛选总酸含量较高的优良单株。

Molecular marker closely linked with QTL locus of total acid content of Actinidia chinensis and its application

The invention discloses a total acid content of kiwifruit traits QTL loci closely marking and application of molecular chain, primers according to the molecular marker design for TA F forward primers for 5 'GTAAATGCATGGTAAAGAGGTCC 3', TA R reverse primers for 5 'AGGAGAAAGGGAAAATAAAACGC 3'. This invention is the first major QTL sites located in the control of total acid of kiwifruit, explained 21.75% of the phenotypic variance, molecular markers by detecting the content of total acids and the total acid content of kiwifruit can be predicted, and then accurate rapid screening of fine plant higher total acid content.

【技术实现步骤摘要】
一种与猕猴桃总酸含量性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用
本专利技术属于分子生物学及遗传育种
，更具体涉及一种与猕猴桃总酸含量性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用。
技术介绍
猕猴桃富含维生素C、膳食纤维和多种矿物质营养，是一种深受消费者青睐的健康水果。中国是猕猴桃属植物的原始起源中心，猕猴桃资源极为丰富，遗传多样性高，中国拥有全世界猕猴桃物种资源总数的96％左右。凭借丰富的自然资源，选育聚合优良性状的新品种，对猕猴桃产业的健康稳定发展起到关键作用。猕猴桃果实的主要酸组分为奎宁酸和柠檬酸，同时含有少量苹果酸成分。果实中糖、酸含量及其比值对果实风味品种有着非常重要的影响。因此降低总酸含量对改善猕猴桃果实品质至关重要，是猕猴桃育种的重要目标之一。传统猕猴桃育种中，童期长、种植占地面积大等是影响育种效率的主要困难。随着分子生物学和测序技术的迅猛发展，对性状的选择正在逐渐由表型选择向基因型选择过渡。分子标记辅助育种能利用与目标性状基因紧密连锁或共分离的分子标记对个体进行筛选，以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的。近年来，在苹果、梨、葡萄等果树中，已成功开发了重要农艺性状分子标记，利用分子标记进行辅助选择也日趋成熟。然而，猕猴桃重要农艺性状定位及相关分子标记开发工作比较匮乏。2013年，猕猴桃基因组草图的公布为基因组学研究和猕猴桃分子辅助育种提供了重要基础。随后，基于构建猕猴桃高密度遗传图谱，开发了3个性别鉴定标记，在育种早期进行性别鉴定，避免了人力和物力的浪费。农艺性状QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。利用遗传连锁图谱，结合表型数据开展数量性状位点(QuantitativeTraitLoci，QTL)扫描，已成为解析复杂数量遗传学规律、有效定位关键农艺性状、开发关联分子标记以及对优良性状进行早期选择的有效手段。目前，对猕猴桃重要品质性状总酸的QTL定位以及发掘与总酸相关的分子标记研究尚未开展。开展猕猴桃总酸的QTL研究，基于QTL位点信息进行分子标记筛选，有助于提高对猕猴桃总酸性状选择的育种效率，节约育种成本，提升猕猴桃产业经济效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种猕猴桃第21号染色体第6144693个碱基在猕猴桃总酸含量筛选育种中的应用，包括针对猕猴桃第21号染色体第6144693个碱基设计的引物在猕猴桃总酸含量筛选育种中的应用，包括包含有猕猴桃第21号染色体第6144693个碱基的猕猴桃序列在猕猴桃总酸含量筛选育种中的应用。本专利技术的目的在于提供了一种与猕猴桃总酸含量性状QTL位点紧密连锁的分子标记的引物，引物为TA-F：5’-GTAAATGCATGGTAAAGAGGTCC-3’和TA-R：5’-AGGAGAAAGGGAAAATAAAACGC-3’。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种与猕猴桃总酸含量性状QTL位点紧密连锁的分子标记的获得：①使用总酸含量高的山梨猕猴桃‘MT570001’猕猴桃和总酸含量低的中华猕猴桃‘桂海4号’杂交构建F1分离群体。在该群体结果第6年，选择125株F1群体的后代单株为研究对象。②采集群体125份单株叶片，利用CTAB法提取总DNA。根据RADseq方法构建中华猕猴桃‘桂海4号’、山梨猕猴桃‘MT570001’以及125株子代的文库并测序。③将测序数据进行过滤，去除低质量碱基含量大于50％的序列，剔除有测序接头污染和大量重复的序列。使用软件SOAP2将符合过滤标准的测序数据比对到参考基因组，对每个样本进行位点变异检测，统计多态性位点在群体中的遗传类型。④利用Joinmap4.0分析软件构建基于SNP标记的猕猴桃遗传图谱。将符合遗传分离规律的多态性标记位点，按Joinmap4.0软件格式导入，剔除数据缺失率在10％的位点，排除显著偏分离位点，采用Kosambi作图函数构建高密度遗传图谱。⑤在果实成熟期，对中华猕猴桃‘桂海4号’、山梨猕猴桃‘MT570001’以及125株群体单株果实的奎宁酸、柠檬酸和苹果酸含量进行测量。每个样本随机采集10个果实，使用Agilent7890N气相色谱仪通过气相色谱法测定果实的奎宁酸、柠檬酸和苹果酸含量，将奎宁酸、柠檬酸和苹果酸含量的总和计为果实的总酸含量。⑥将样本总酸含量数据和标记的基因型数据导入MapQTL5.0软件，选择多区间作图法，设置LOD阈值为3.0，对猕猴桃总酸进行QTL定位分析。最终检测到与总酸含量相关的主效QTL位点，对该性状的贡献率为21.75％，该位点与对应的SNP标记在连锁群上的遗传距离为67.7cM。⑦提取猕猴桃第21号染色体第6144693个碱基上下游各100bp的序列，按照设计引物原则，开发设计SNP标记引物。正向引物TA-F为5’-GTAAATGCATGGTAAAGAGGTCC-3’，反向引物TA-R为5’-AGGAGAAAGGGAAAATAAAACGC-3’。扩增产物大小为150bp。本专利技术的保护范围包括：猕猴桃第21号染色体第6144693个碱基在猕猴桃总酸含量筛选育种中的应用，或者基于猕猴桃第21号染色体第6144693个碱基设计的引物在猕猴桃总酸含量筛选育种中的应用，或是SEQIDNO.3所示序列在猕猴桃总酸含量筛选育种中的应用。以上所述的应用，可利用现有技术，对待检猕猴桃的第21号染色体的第6144693个碱基进行检测，实现对猕猴桃总酸含量进行早期筛选的育种目的。本专利技术的积极效果：本专利技术首次定位了猕猴桃中控制总酸的主效QTL位点，可解释21.75％的表型方差。在常规育种方法中，猕猴桃总酸含量的测定要等到成熟期，浪费大量时间和精力，且选择效率低下，而通过检测与总酸含量主效位点连锁的分子标记，可以在早期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本专利技术中猕猴桃总酸的主效基因位点位置明确，分子标记位点的检测方法方便快捷，不受环境影响。通过检测与总酸性状相关的分子标记，即可预测猕猴桃总酸含量，进而准确快速筛选总酸含量低的优良单株。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，为常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：与猕猴桃总酸主效QTL及开发连锁的分子标记的获得：①本实施例中使用总酸含量高的山梨猕猴桃‘MT570001’猕猴桃和总酸含量低的中华猕猴桃‘桂海4号’杂交构建F1分离群体。在该群体结果第6年，选择125株F1群体的后代单株为研究对象。②采集群体125份单株叶片，利用CTAB法提取总DNA。根据RADseq方法构建中华猕猴桃‘桂海4号’、山梨猕猴桃‘MT570001’以及125株子代的文库并测序。③将测序数据进行过滤，去除低质量碱基含量大于50％的序列，剔除有测序接头污染和大量重复的序列。使用软件SOAP2将符合过滤标准的测序数据比对到参考基因组，对每个样本进行位点变异检测，统计多态性位点在群体中的遗传类型。④利用Joinmap4.0分析软件构建基于SNP标记的猕猴桃遗传图谱。将符合遗传分离规律的多态性标记位点，按Joinmap4.0软件格式导入，剔除数据缺失率在10％的位点，排除显著偏分离位点，采用K本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猕猴桃第21号染色体第6144693个碱基在猕猴桃总酸含量筛选育种中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种猕猴桃第21号染色体第6144693个碱基在猕猴桃总酸含量筛选育种中的应用。2.包含有猕猴桃第21号染色体第6144693个碱基的猕猴桃序列在猕猴桃总酸含量筛选育种中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，所述的序列为SEQIDNO.3所示。4.针对猕猴桃...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟彩虹，张琼，黄宏文，姚小洪，刘义飞，刘春燕，
申请(专利权)人：中国科学院武汉植物园，
类型：发明
国别省市：湖北,42