一种菠菜SSR标记的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种菠菜SSR标记的制备方法，包括以下步骤：获取菠菜基因组或转录组测序数据；利用SSR检索程序进行SSR位点搜索；采用引物设计软件设计含有SSR位点的引物序列；提取菠菜材料的总DNA；利用形态特征差异明显的菠菜材料的DNA筛选出差异SSR标记。本发明专利技术还公开了上述菠菜SSR标记的应用，其应用步骤包括：用差异SSR标记扩增目标菠菜材料和F2群体；计算每对引物的多态性信息含量；对目标菠菜材料进行遗传多样性聚类及群体结构分析。本发明专利技术开发了大批量的SSR引物，为利用SSR分子标记进行菠菜种质资源多样性、连锁图谱构建、亲缘关系研究及分子辅助选育技术奠定了基础。

Preparation method and application of spinach SSR mark

The invention discloses a preparation method of spinach SSR markers, including the following steps: acquiring spinach genome or transcriptome sequencing data; search program for SSR site search using SSR; using primer design software primer sequences containing SSR loci; total DNA extracted from spinach materials; using morphological characteristics difference of spinach materials DNA selected153differentially SSR marker. The present invention also discloses the application of the spinach SSR markers, the application steps include: amplification of target materials and F2 groups with different spinach SSR marker; polymorphism information content per primer; genetic diversity analysis of cluster and population structure on target material of spinach. The invention has developed a large number of SSR primers, which lays the foundation for using SSR molecular markers to carry out the diversity of spinach germplasm resources, the construction of linkage maps, the study of the relationship and the techniques of molecular assisted breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种菠菜SSR标记的制备方法及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种菠菜SSR标记的制备方法及应用。
技术介绍
菠菜(SpinaciaoleraceaL.)是重要的叶菜类经济作物之一，生长周期短，复种指数高，在我国南北方普遍种植。我国是最大的菠菜生产和消费国家，年产量1200多万吨，约占世界总产量的90％。菠菜即可生食(拌沙拉)，也可熟食(炒、拌、做汤)，还可加工出口。菠菜营养丰富，富含纤维素、维生素以及铁、钙等，其含有的胡萝卜素和多种维生素、氨基酸，对预防肺癌和子宫癌有益处。菠菜起源于波斯地区(今伊朗及周边)，于公元647年传入中国，已在世界上广泛栽培，包含2个野生种和1个栽培种，具有十分丰富的种质资源。目前菠菜种质资源的研究主要集中于对植物学性状的描述和品质性状测定上，虽然表型和品质性状的调查及测定快捷简便，可以对植物材料做出快速且较直观的比较和分类，但易受环境因素和植物生长发育时期的影响，而利用分子标记研究菠菜种质资源遗传，则不受样品形态和环境因素的影响，并且分子标记试验所需样品用量少，标记数目多，重复性高，结果可靠，能检测整个基因组及提供中立、客观的遗传多样性评价。目前对于菠菜的遗传多样性研究主要局限于TRAP等通用的分子标记技术，虽然已经开发出部分SSR标记，但标记的数量小，应用局限，不利于后期的研究。简单重复序列(Simplesequencerepeat，SSR)，又叫微卫星(microsatellite)，主要是以1-6核苷酸为核心序列的简单串联重复序列，其长度大多在100-300bp。微卫星包括重复基本基序所构成的核心序列与其两侧的侧翼序列。SSR标记利用简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，经过PCR扩增，根据条带的大小来反映DNA序列的多态性。与其它分子标记相比，SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好、特异性强等特点，然而传统SSR标记的开发费时费力、开发成本高，阻碍了该技术在分子遗传育种等领域的应用。
技术实现思路
本专利技术针对目前菠菜分子生物学研究基础及分子遗传育种技术薄弱的不足，开发菠菜SSR标记的引物序列，并将其应用于菠菜种质资源遗传多样性评价、遗传连锁图谱构建及QTL定位的研究。本专利技术的具体技术方案如下：本专利技术一方面提供了一种菠菜SSR标记的制备方法，包括以下步骤：步骤1、获取菠菜基因组或转录组测序数据；步骤2、利用SSR检索程序进行SSR位点搜索；步骤3、采用引物设计软件设计含有上述SSR位点的引物序列；步骤4、提取菠菜材料的总DNA；步骤5、利用形态特征差异明显的菠菜材料的DNA筛选出差异SSR标记。优选地，在上述步骤1中，获取菠菜转录组数据的27376条Unigene序列。优选地，在上述步骤2中，利用MicroSAtellite(MISA)程序进行SSR位点搜索，搜索条件为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5和5次。优选地，在上述步骤3中，采用Primer3.0软件对含有SSR位点的Unigene序列批量设计引物。更优选地，设计上述引物的主要参数为：(1)退火温度在55～65℃之间，上、下游引物的Tm相差≤2℃；(2)PCR产物大小在100～300bp；(3)引物长度在18～24bp之间；(4)GC含量在40％～60％之间。优选地，在上述步骤5中，差异SSR标记为筛选出的在形态特征差异明显的12个菠菜材料的DNA中存在多态性的标记。优选地，上述差异SSR标记至少包括如表2所示的20对具有多态性的SSR标记。优选地，上述菠菜材料至少包括自然群体、F2群体、回交群体、重组自交系、双单倍体群体、近等基因系、残留异质系、QTL等基因系、导入系、单片段代换系和染色体片段代换系中的一种或几种。更优选地，上述植物材料为菠菜自然群体。本专利技术在另一方面提供了根据上述制备方法得到的菠菜SSR标记在菠菜种质资源多样性、连锁图谱构建、亲缘关系研究及分子辅助选育技术中的应用。根据上述制备方法得到的菠菜SSR标记的应用，包括以下步骤：步骤1、用上述差异SSR标记扩增目标菠菜材料和F2群体；步骤2、计算每对引物的多态性信息含量；步骤3、对目标菠菜材料进行遗传多样性聚类及群体结构分析。本专利技术的有益效果在于，共开发菠菜转录组SSR位点7410个，设计SSR特异引物5932对，随机合成60对SSR引物，其中20对能成功地在84份菠菜种质资源中扩增出多态性，20对引物共获得64个多态性位点，最多一对引物检测到了5个多态位点，平均每对引物能检测到3.1个多态性位点。20对SSR引物在84份材料中检测到的多态性信息含量(PIC值)范围为0.137-0.668，平均PIC值为0.41；基因多样性范围为0.144-0.720，平均0.475；期望杂合度为0.012-0.988，平均值0.413。84份材料的相似系数范围是0.64-0.98，被这些引物分成不同的组别，且基本与其形态特征相吻合。此外群体结构分析表明在Q值＝0.612时，可以将84份菠菜材料分为2个组，分别为Q1和Q2。以下将结合附图对本专利技术作进一步说明，以充分说明本专利技术的目的、技术特征和技术效果。附图说明图1为本专利技术较优实施例中的SSR标记对菠菜材料的扩增电泳图；图2为本专利技术较优实施例中的SSR标记分析的84份菠菜材料的聚类图；图3为本专利技术较优实施例中的SSR标记分析的84份菠菜材料的群体结构图。具体实施方式在描述本专利技术之前，应当理解本专利技术不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本专利技术的范围将仅由所附的权利要求书限制。以84份菠菜种质资源为例进行说明。本专利技术提供的菠菜SSR标记的制备方法以及应用，具体按照以下步骤完成：(1)、从Spinachbase(http://www.spinachbase.org)获取菠菜基因组或转录组测序数据；(2)、利用MicroSAtellite(MISA)程序进行SSR位点搜索；(3)、用Primer3.0软件批量设计含有SSR位点的引物序列；(4)、获取菠菜材料植株嫩绿叶片，提取总DNA；(5)、用步骤(3)所设计合成的SSR标记的引物序列扩增步骤(4)中如表1所示的形态特征差异明显的12份菠菜材料；(6)、获得在步骤(5)中12份菠菜材料中有差异的EST-SSR标记，其序列如序列表2所示；并用所获差异SSR标记扩增所有菠菜材料；表1示出了本专利技术较优实施例中所用的84份菠菜植物材料(7)、计算每对引物的多态性信息含量；(8)、对所有菠菜材料进行遗传多样性聚类及群体结构分析。以下通过实施例对本专利技术作进一步描述。实施例1：1、供试材料(如表1所示)：选择形态特征差异的菠菜材料12份(编号分别为1、2、3、4、6、16、24、69、77、88、98和106，剩余菠菜材料72份，其中3份为野生型种质，种植于实验大棚中。2、SSR标记的制备及引物设计：使用MicroSAtellite(MISA)程序进行SSR位点搜索，搜索标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5和5次。结果表明：通过对菠菜转本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菠菜SSR标记的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤1、获取菠菜基因组或转录组测序数据；步骤2、利用SSR检索程序进行SSR位点搜索；步骤3、采用引物设计软件设计含有所述SSR位点的引物序列；步骤4、提取菠菜材料的总DNA；步骤5、利用形态特征差异明显的菠菜材料的DNA筛选出差异SSR标记。

【技术特征摘要】
1.一种菠菜SSR标记的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤1、获取菠菜基因组或转录组测序数据；步骤2、利用SSR检索程序进行SSR位点搜索；步骤3、采用引物设计软件设计含有所述SSR位点的引物序列；步骤4、提取菠菜材料的总DNA；步骤5、利用形态特征差异明显的菠菜材料的DNA筛选出差异SSR标记。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，获取菠菜转录组数据的27376条Unigene序列。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤2中，利用MicroSAtellite程序进行SSR位点搜索，搜索条件为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5和5次。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤3中，采用Primer3.0软件对含有所述SSR位点的Unigene序列批量设计引物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，设计所述引物的主要参数为：(1)退火温度在55～65℃之间，上、下游引物的Tm相差≤2℃；(2)PCR产物大小在10...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡晓锋，葛晨辉，王全华，王小丽，徐晨曦，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：上海,31