纯化(多)肽的制备制造技术

用于方便纯化（多）肽的多肽修饰方法，该修饰方法包括：在（多）肽合成过程中，向（多）肽链末端插入至少一种可特异性裂解的氨基酸，并且该（多）肽序列中若有同种氨基酸时要加以保护使其不被裂解，从而使得特异性裂解精确地发生在可特异性裂解的氨基酸处。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于方便纯化(多)肽的制备的修饰方法，还涉及一种利用该修饰方法的纯化工艺。近些年来，采用t-Boc或F-moc策略的固相肽合成技术有了很大的改进。复杂的合成方法可以制备约100个或更多残基的多肽1-4。然而，由于在肽合成的每一个循环都有可能发生不完全连接和链终止，导致缺失序列和截短序列的形成。这些以及可能发生的副反应(主要发生在从树脂上最后切离过程中)妨碍了直接从其它杂质中分离所需求的肽。长合成多肽的纯化是用于生物学研究和用于人及动物的产品生产中的主要问题，因为它们必需是高纯度的。尤其是，当合成的序列包含30个或更多个残基时，所需求的产物与缺失的肽、截短的肽或修饰过的肽等杂质的物理性质如大小、电荷、疏水性等差异太小，无法得到充分的纯化。另外，如反相HPLC的现代的高效分离技术常常受到收率低、载样量小的限制，使得这些技术耗时多，花费高。人们已经试验了多种不同的方法来克服这种限制。有人将一种153个残基的IL-1合成蛋白质5和一种99个残基的SIV蛋白质酶合成蛋白质6生物素化，然后在一种抗生物素蛋白质-琼脂糖柱上分离生物素化的肽链。Ball等人7最近提出了一种纯化方法，该方法基于加入一种可逆的保护基团，使得肽链的最后一个残基具有亲脂性、酸性或碱性。有人利用合成序列中存在的特定残基优化了更为特异的层析方法。例如，含半胱氨酸的肽通过与固定化的汞衍生物8或活化的硫醇9反应而得到的纯化，且固定化金属离子亲和层析方法(IMAC)10也已成功地用于含组氨酸或色氨酸的肽的纯化11。重组蛋白质中有目的地加入组氨酸尾巴、B细胞表位或者GST组分，然后可利用这些尾部结构进行亲和层析。一般地，一种基于合成肽的物理化学性质的纯化方案必须根据每一个特定的样品进行优化，而这是一种耗时多、花费高的过程。因此，为了获得通用的纯化方法，开发了许多技术15。然而，迄今为止所报道的纯化方法都不尽如人意，因为这些方法需要花费大量的时间和/或终纯化产物中存留共价衍生的肽，而这就可能影响产品的生物和物理化学性质，及其在动物和人中的应用。因此，本专利技术的目的就是要通过提供一种用于方便其纯化的多肽的修饰方法来改进已知的方法，并且改进(多)肽的纯化工艺，该方法及工艺普遍适用，具有高回收率且易于操作。通过一种修饰方法实现了本专利技术的目的，该修饰方法包括在(多)肽链合成过程中，向其末端插入至少一个可特异性裂解的氨基酸，并且，(多)肽中若有同种氨基酸时要加以保护使其不被裂解，从而使得特异性裂解精确发生于可特异性裂解的氨基酸处。一种利用该修饰方法的纯化工艺包括下列步骤a)合成所需求的(多)肽；b)在(多)肽的末端加入至少一种可特异性裂解的氨基酸，并且，(多)肽中若有同种氨基酸时要加以保护使其不被裂解；b)用一种标记序列延长(多)肽和加入到其上的氨基酸以得到延长的多肽；c)使用一种标记特异性的纯化方法纯化延长肽；且d)通过一种特异于所加入氨基酸的裂解方法从延长(多)肽中去除标记序列和所加入的氨基酸，以得到纯化的多肽。特异性裂解方法优选是化学裂解法，下面将做进一步的说明。本专利技术的方法和工艺适用于每一种(多)肽，因为它不依赖于其氨基酸组成。而且，在特定优选实施方案中，该方法和工艺花费不多且效率很高。在一种优选实施方案中，加入亲和标记(例如，6个组氨酸残基序列或者其它方便纯化的化合物)之前，使用甲硫氨酸残基作为添加的氨基酸。在经过例如标记特异性的亲和层析等适当的纯化步骤以后，使用在甲硫氨酸残基处特异性裂解的CNBr消化法以切除组氨酸标记。CNBr消化法是一种花费不多而效率很高的方法。在一种优选实施方案中，标记包括至少一个组氨酸残基序列(优选6个或6个以上)和一个甲硫氨酸残基。也可以任选地加入一种或多种其它氨基酸。如果所需求的多肽序列中含有甲硫氨酸残基，那么当用溴化氰除去标记时，它们也将被裂解。然而，根据本专利技术就可以避免这种情况的发生，方法是在(多)肽合成过程中使用修饰过的甲硫氨酸残基。这种修饰过的甲硫氨酸残基的一个例子为甲硫氨酸亚砜。本专利技术方法和工艺的另一实施方案中，标记是一种如聚乙二醇的大分子。在这种情况下标记特异性的纯化方法是凝胶过滤层析法。本专利技术的方法和工艺同样适用于由重组DNA技术生产的多肽。在优选实施方案中，所需求的多肽中原有的而不在标记中的甲硫氨酸残基经裂解保护，例如用如缬氨酸、甘氨酸等其它氨基酸取代或者被删除。在本申请中，“标记”是指在所需求肽的合成过程中或者在其合成之后加入到其上的一种可去除的分子。一个“标记”可以是在多肽合成过程中加入的一种氨基酸序列，也可以是一种易于从组分混合物中纯化出来的其它分子。后者的一个例子是聚乙二醇(PEG)。在本申请中，术语“肽”、“多肽”、和“(多)肽”可以替换使用。下面给出一个实施例来说明本专利技术。很显然，熟练技术人员完全可以根据本实施例设计出落在本专利技术专利保护范围内的其它方法。本实施例公开了一种通用的纯化方法，它基于下面的组合1)一种加帽(capping)方法，2)在天然序列的合成过程中使用甲硫氨酸亚砜作为经保护的甲硫氨酸，并且3)使用1个甲硫氨酸、2个甘氨酸残基和用于亲和层析的6个组氨酸终序列来延长所需求的肽。在充分的纯化步骤后，组氨酸标记用溴化氰裂解，然后将甲硫氨酸亚砜最终还原为甲硫氨酸。采用这种简单、直接的策略，利用传统的层析方法就可以在短时间内高产量地将69个残基的多肽“PbCs242-310”纯化至均质，该多肽覆盖Plasmodiumberghei的CS蛋白质的C-末端区。实施例1．材料与方法1.1试剂与溶剂用于肽合成的化学药品和溶剂购自Calbiochem-Novabiochem AG(Laufelfingen，瑞士)和Fluka(Buchs，瑞士)。1.2肽的合成与分析为说明本专利技术，采用Applied Biosystem 431A肽合成仪以固相F-Moc化学法化学合成了一种命名为“PbCs242-310”的多肽12，其覆盖Plosmodium berghei CS蛋白质的C-末端区。该多肽的制备在一种F-moc-叔丁基丝氨酸-对-烷氧基苯甲醇树脂(Wang树脂)上进行，反应规模为0.1mmol时，该树脂的取代度为0.43mmol/g。合成在如下条件下进行使用5倍过量的F-moc氨基酸衍生物；DCCI和HOBt作为活化剂；开始的34个氨基酸连接时间为60分钟，后面的残基连接时间加倍。每一个反应循环结束时用乙酸酐进行加帽。侧链保护基团包括用五甲基代苯并二氢吡喃磺酰基基团保护Arg；用-S-叔丁基基团保护Cys；用三苯甲基基团保护Asn、Gln和His；用叔丁氧羰基基团保护Lys和Trp；用叔丁基基团保护Asp、Glu、Ser、Thr和Tyr。Met-306以F-moc-甲硫氨酸亚砜的形式插入以防止其以后被溴化氰裂解。下一步，用序列His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Met-将该肽向N-末端方向延长，反应条件与上所述相同，只是在连接了第二个Gly以后省略加帽步骤。这样得到的多肽命名为“组氨酸标记的PbCs 242-310”。在室温下将肽-树脂用溶解在TFA中的2.5％H2O、5％三乙基硅烷处理2小时，以得到肽的粗制品。然后将此合成肽用体积排阻液相层析法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：M·罗吉洛，G·克拉丁，C·雷蒙德，N·法塞尔，
申请(专利权)人：RMF迪克塔吉恩有限公司，
类型：发明
国别省市：