合成和分离肽的酶膜方法技术

本发明专利技术结合已知的方法，克服了中间体复合物的沉淀和／或酶迅速地减活问题。它提供了一种膜方法，适于移动化学平衡完成肽的合成。本发明专利技术公开了使用象酰化氨基酸水解酶Ｉ那样的酯酶酶转化不带电的物质。可以从产物混合物中分离出共渗反应物并且返回到反应混合物中。再者离子排斥膜也可以用来拆分包括Ｄ，Ｌ—氨基酸的外消旋羟酸对映体。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术一般是关于使用一种对不带电的肽可渗透而对带电的肽可渗透而对带电的肽不渗透的膜合成和分离肽的酶方法，尤其是关于同时合成和纯化L，L-二肽，以及将其应用于制备L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(天冬甜母)。众所周知，从早期蛋白质化学以来，使用蛋白酶作缩合催化剂立体定向偶联两个氨基酸生成L，L-肽。早在1909年，Mohr和Strohschein描述了在降解酶蛋白质的木爪蛋白酶存在下，Bz-Leu-OH和H-Leu-NHz反应生成不溶于水的二肽Bz-Leu-Leu-NHz。E.Mohr和F.Strohschein Ber42，2521(1909)。Mohr和Strohschein的类型反应仅在那些形成肽键的氨基酸之间进行是可能的。这些形成的肽键对使用木瓜蛋白酶或其它酶解离敏感。的确，在氨基酸反应物和肽产物之间的缩合反应平衡很大程度上向反应的氨基酸的反应物方向移动。然而，假使二肽产物是不易溶解的，且从反应相中沉淀出来，由于质量作用能驱使缩合反应的完成。由于某些肽商业使用的重要性以及公知的在温和条件下酶催化形成肽的事实，关于肽的酶合成，特别是简单的二肽合成进行了大量的研究。K.Oyama和K.Kihara，Kagaku Sosetsu 35.195(1982);K.Oyama和K.Kihara，Chem Tech.14，100(1984)。肽的衍生物天冬甜母(aspartame)合成方法在U.S.P 4，165，311中已做过介绍，此后称为“311”方法。它包括N-苄氧羰基-L-天冬氨酸与D，L-苯基丙氨酸甲酯嗜热菌蛋白酶催化缩合作用和一种中间复合物N-苄氧羰基-天冬甜母的D-苯基丙氨酸甲酯盐沉淀作用，以驱动反应到肽产物一侧。这种中间复合物进一步处理容许回收D-苯基丙氨酸甲酯，消旋后这些甲酯可重新循环使用。处理N-苄氧羰基-天冬甜母衍生物，退减N-苄氧羰基保护基团这些衍生物能转变成天冬甜母。“311”方法必须在分批基础上进行，这比较麻烦，而且使酶回收复杂化。也可参看K.Oyama，S.Irino，T.Harada和N.Hagi.Ann.N.Y.Acad.Sci 434，95(1985)。Willi Kullmann，Enzymatic Peptide Synthesis(1987)。通过满足嗜热菌蛋白酶的活性部位施加于结构的需求并且通过促使中间复合物的不溶性而增加反应收率，在“311”方法中，N-苄氧羰基保护基团起主要的作用。在温和的条件下，可以进行从天冬甜母衍生物中消去N-苄氧羰基保护基团，即催化氢化作用防止甲基酯功能团解离。催化氢化涉及到大规模处理氢气的不便。在化学文献中也已经描述过驱动酶缩合反应完成的其它方法。例如，已经发现有机溶剂作反应介质对增加肽产量收率有效，尽管它随酶稳定性下降已经使其不能大规模地实际运用。K.Oyama，S.Nishimura，Y.Nonaka，K.Kihara和T.Hashimato，J.Org.Chem 46，5241(1981);H.Ooshima，H.Mori和Y.Harano，Biotechnology Ietters 7，789(1985)，K.Nakanishi，T.Kamikubo和R.Matsuno，Biotechnology 3，459(1985)。考虑到现有技术的工艺方法中用于肽的酶合成存在上述难解决的问题，特别是沉淀一种中间复合物和处理危险试剂的需要，将提供一种改进的方法避免这些困难的问题，同时安全地提供有效收率而不快速失去酶催化剂的活性。本专利技术提供了一种合成和纯化一种化合物的方法，步骤包括偶联第一种反应物和第二种反应物以生成一种膜可运载的化合物;通过膜输送可运载的化合物而该膜不输送反应物，不可逆地把输送过去的化合物转变成一种通过膜无法逆向运载的形式。本专利技术也提供一种酶合成和化合物纯化方法，步骤包括使用一种在含水混合物中缩合酶偶联第一种化合物和第二种化合物，第一种化合物包括一种质子化了的氨基团(铵)，第二种化合物包括一种游离的羧酸酯基团，产生一种不带电(或非电离)被偶联的化合物;通过一种膜渗透从含水的混合物中持续去除不带电的被偶联的化合物，这种膜选择性地运载不带电被偶联化合物到膜的产物一侧。运载的偶联化合物最好是一种肽或其衍生物，它们转变成一种带电(或电离)的分子以致通过膜不发生逆向扩散。因而由于它不断地从中被去除，在反应混合物中有利于形成偶联的化合物产物。本专利技术也提供一种肽衍生物酶的合成方法，如天冬甜母和其类似物的合成，步骤包括一种N-酰基-β-取代的-L-天冬氨酸和苯基丙氨酸低烷基酯缩合，前者有α-羧酸酯基团后者有α-铵基团，在包含一种缩合酶的含水反应混合物中缩合形成N-甲酰基-L-天冬氨酰-(β-被取代的)-L-苯基丙氨酸低烷基酯(即1-6个碳)，一种不带电的肽;从含水的反应混合物中把不带电的肽通过一种选择通透膜输送到产物混合物中。本专利技术也提供一种肽的酶合成方法，步骤包括在含水的初始反应混合物中缩合第一种和第二种氨基酸化合物以形成一种不带电的化合物;把这种不带电的化合物通过一种膜运载到含水的第二种反应混合物中，该膜不运载大量的氨基酸化合物;转化被运载过的不带电化合物为一种通过膜不能逆向运载到初始反应混合物的形式。被运载过的化合物，已转化成通过膜不能逆向运载的形式，可以从第二种反应混合物中除去。而且与不带电化合物共通透膜进入第二种反应混合物的第一种和第二种氨基酸化合物可从第二种反应混合物中分离出来，选择性地返回到初始反应混合物中。本专利技术也提供一种氨基酸化合物酶拆分的一种方法，步骤包括在一种水解酶在内的含水反应混合物中水解D，L-氨基酸化合物，在含水反应混合物中形成一种带电的L-氨基酸化合物和不带电的D-氨基酸化合物;把含水的反应混合物中的不带电的D-氨基酸化合物通过一种离子排斥膜运载到产物混合物中，因此促进拆分一种对映体。在产物混合物中可以积累不带电的D-氨基酸化合物并能用通常方法回收。这种氨基酸化合物酶拆分的方法可与上面讨论过的其它方法相结合。本专利技术的目的之一是提供一种肽的酶合成方法，同时提供了肽产物的合成和纯化。本专利技术的另一目的是提供一种肽及其衍生物，特别是天冬甜母安全、经济、有效的合成和纯化的方法。本专利技术的另一目的是提供一种肽的酶合成经济方法，并提供高效利用酶和在持续的基础上进行合成的方法。本专利技术还有一个目的是提供一种方法，该法尤其适用于使用D，L-苯基丙氨酸和N-保护基-β-取代基-天冬氨酸盐进行天冬甜母和其衍生物的酶合成，收率基本上定量。通过本专利技术可以得到上述和另外的目的和优点，这可以在下面结合附图所做的详细介绍中清楚地看出。图1是依据本专利技术天冬甜母的一种酶合成图示说明。图2是运用本专利技术方法仪器图解说明。图3是说明在例1和例2这段时间生成产物(天冬甜母衍生物)量的图。图4是说明在例4这段时间形成产物(天冬甜母衍生物)量的图。图5是说明在例5这段时间形成产物(天冬甜母衍生物)量的图。图6是说明在例6这段时间形成产物(天冬甜母衍生物)量的图。图7是说明在例7这段时间形成产物(天冬甜母衍生物)量的图。图8是说明在例8这段时间形成产物(天冬甜母衍生物)量的图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肽的酶合成方法，包括以下步骤：带有α—羧酸酯基团的一种Ｎ—酰基—β—取代的—Ｌ—天冬氨酸和带有α—铵基团的一种苯丙氨酸低级烷基酯，在含有缩合酶的含水反应混合物中缩合，形成Ｎ—酰基—Ｌ—天冬氨酰—（β—取代的）—Ｌ—苯丙氨酸低级烷基酯 ，一种不带电的肽；从含水反应混合物中穿过离子排斥膜运载不带电的肽到产物混合物。

【技术特征摘要】
US 1987-7-28 078,504;US 1986-8-18 897,6791.一种肽的酶合成方法，包括以下步骤带有α-羧酸酯基团的一种N-酰基-β-取代的-L-天冬氨酸和带有α-铵基团的一种苯丙氨酸低级烷基酯，在含有缩合酶的含水反应混合物中缩合，形成N-酰基-L-天冬氨酰-(β-取代的)-L-苯丙氨酸低级烷基酯，一种不带电的肽；从含水反应混合物中穿过离子排斥膜运载不带电的肽到产物混合物。2.根据权利要求1的方法，其中缩合酶是在PH值范围约为4.0到9.0中的一种可以产生蛋白酶活性的肽。3.根据权利要求2的方法，还包括将产物混合物中的不带电的肽转变成一种不能穿过膜逆向渗透的物质。4.根据权利要求3的方法，其中不带电的肽用一种酯酶解离转变成一种带电的物质。5.根据权利要求4的方法，其中酯酶是在PH值约为6.0到9.0范围内起活性作用。6.根据权利要求4的方法，其中酯酶选自酰化氨基酸水解酶I，α-胰凝乳蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶A。7.根据权利要求4的方法，其中酯酶为酰化氨基酸水解酶I并且反应混合物的PH约为7.0。8.根据权利要求3的方法，其中膜是一种通过在微孔板上细孔中的毛细作用固定的与水不相混溶的有机液体，该有机液体是不带电二肽溶剂。9.根据权利要求8的方法，其中微孔板选自聚四氟乙烯和聚丙烯材料制成并且有机溶剂至少是一种选自正-1-癸醇、正-十六醇、正-十二醇、N，N-二乙基-十二酰胺、十二烷、2-十一烷酮的化合物及混合物。10.根据权利要求8的方法，其中微孔板是聚丙烯空心纤维并且溶剂是N，N-二乙基-十二酰胺和十二烷。11.根据权利要求8的方法，其中膜是一种Bend2型空心纤维选择性的通透膜。12.根据权利要求3所说的方法，其中第一种化合物是D，L-苯丙氨酸甲酯，第二种化合物是具有α-羧酸酯基团的N-酰基-β-取代的-L-天冬氨酸。13.根据权利要求12的方法，其中N-酰基团选自φCH2OCO-，CH＝0和φCH2CO;β-取代基选自φCH3O-，叔-丁氧基(ter Buo-)、CH3O-、NH2-。14.根据权利要求3的方法，其中缩合酶被固定。15.根据权利要求14的方法，其中缩合酶是嗜热菌蛋白酶，反应混合物PH值约为7.0。16.根据权利要求14的方法，还包括从反应混合物中穿过离子排斥膜运载不带肽前，将反应混合物PH值调到约5.0步骤。17.根据权利要求3的方法，还包括分离共渗透离子排斥膜进入产物混合物的N-酰基-β-取代-L-天冬氨酸的步骤。18.根据权利要求3的方法，还包括分离共渗透离子排斥膜进入产物混合物的苯丙氨酸低级烷基酯的步骤。19.一种肽的酶合成方法，包括以下步骤带有α-羧酸酯基团的一种N-酰基-β-取代的-L-天冬氨酸和带有α-铵基团的一种苯丙氨酸低级烷基酯，在含有缩合酶的含水反应混合物中缩合，形成N-酰基-L-天冬氨酰-(β-取代的)-L-苯丙氨酸低级烷基酯，一种不带电的肽;从含水反应混合物中穿过离子排斥膜运载不带电的肽到产物混合物;将产物混合物中的不带电肽转变成经过膜不能逆向渗透的物质;从产物混合物中去除经过膜不能逆向渗透的物质。20.根据权利要求19的方法，它还包括分离共渗透离子排斥膜进入产物混合物的N-酰基-β-取代的-L-苯丙氨酸的步骤。21.根据权利要求20的方法，它还包括分离共渗透离子排斥膜进入产物混合物的苯丙氨酸低级烷基酯的步骤。22.一种肽的酶合成方法，包括以下步骤酶缩合在含水初始反应混合物中的第一种第二种氨基酸化合物，生成一种不带电的化合物;将不带电的化合物经过一种膜运载到含水的第二反应混合物中，其中膜不运载大量的氨基酸化合物;将运载过的不带电化合物转变成穿过膜不能逆向渗透到初始反应混合物中的形态;去除上述穿过膜不能逆向运载回到初始反应混合物中的化合物。23.根据权利要求22的方法，还包括从含水的第二种反应混合物中分离第一氨基酸化合物的步骤，该化合物与不带电的化合物一起经过膜共渗透进入含水的第二反应混合物。24.根据权利要求22的方法，还包括从含水的第二种反应混合物中分离第二氨基酸化合物的步骤，该化合物与不带电的化合物一起经过膜共渗透进入含水的第二反应混合物。25.根据权利要求23的方法，还包括把第一氨基酸化合物返回到含水初始反应混合物的步骤，该化合物与不带电的化合物一起经过膜共渗透。26.根据权利要求23的方法，还包...

【专利技术属性】
技术研发人员：圭莱尔莫A亚科布奇，
申请(专利权)人：可口可乐公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]