检测和纯化对HLA体系中存在的肽特异的CD8+T淋巴细胞群的方法技术

本发明专利技术涉及从Ｉ类ＭＨＣ重组蛋白类似物形成的多聚体，其特征在于所述蛋白包含重链与Ｔ淋巴细胞ＣＤ８共同受体作用区中的至少一个改变，所述改变导致重链和ＣＤ８间相互作用亲和力的降低、甚至抑制。所述多聚体与抗原性肽形成复合物，可用于诊断和治疗目的。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
检测和纯化对HLA体系中存在的肽特异 的CD8十T淋巴细胞群的方法本申请是申请日2000年9月5日、专利技术名称为"检测和纯化对HLA 体系中存在的肽特异的CD8+T淋巴细胞群的方法"的PCT申请的分案申请。本专利技术涉及检测和纯化对HLA体系中存在的肽特异的TCD8+淋巴细 胞群的方法。T淋巴细胞带有其所针对抗原的特异性受体，称为TCR。 TCR由多条 链组成，其中oc和p链参与对存在于HLA分子中的特定抗原性肽的特异 性识别。这种识别体现在T '淋巴细胞a/P TCR以一定亲和性与存在于 耙细胞表面的HLA-肽复合物结合的能力。反过来，可溶性HLA-肽复合物 能够与存在于对所述HLA-肽复合物特异的T淋巴细胞表面的TCR结合。迄今，在分子水平上研究最彻底的系统是CD8+ T淋巴细胞对存在于 I型主要组织相容性复合物的分子中、尤其是所谓HLA-A0201中的抗原 性肽的识别。在该系统中，已确认TCR对HLA-肽的亲和力比抗体对其抗原的亲和 力小得多。因此，利用装栽有肽并标记的可溶性HLA-A0201分子检测携 带对HLA体系中特定肽反应活性之TCR的淋巴细胞是不可能的。为了克 服这种低亲和性，Altman等(l)已制备了一种由HLA重链生物素化的 HLA-A0201-肽复合物组成的多价反应物，它能与链霉抗生物素结合成四 聚体。该HLA-肽四聚体对带有适当TCR的T淋巴细胞具有高亲和力，从 而可用于通过免疫荧光法显现反应活性细胞群。但TCR不是T淋巴细胞中能与HLA-肽复合物相作用的唯一分子。 实际上，在生理识别的情形中，TCR与MHC-肽复合物的结合因CD8共 同受体与I型MHC分子的恒定部分的结合而增强。CD8在该相互作用 中的参与因不同的淋巴细胞克隆而不同，在某些情况下可能导致与给 定HLA-肽复合物结合能力的大幅提高。CD8这种与I类HLA结合的能 力结果导致I类HLA四聚体与带有HLA-肽非特异性TCR的CD8+ T淋巴细胞结合的背景噪音。这种背景噪音随着所用四聚体的浓度而增 加，并可能导致免疫荧光的假阳性。为试图減小这种非特异性标记，大部分研究组在抗CD8抗体的存在下用I类HLA四聚体进行标记。但 只有某些抗CD8抗体有效，而且抗体与四聚体之间的最佳浓度必需在 每次试验时重新调节。由于这些缺点，检测存在于一种非特异性细胞 群中的低含量的特异性亚细胞群(如约0. 1—196)变得很困难。另外，已提出了 HLA四聚体的另一潜在应用。即通过分选(流式细 胞仪或通过免疫磁分选)分离在体外扩增结束时与给定HLA-肽反应的 淋巴细胞群，然后在抗病毒或抗肿瘤的被动免疫程序中发挥治疗应 用。但出于CD8参与的四聚体结合的背景噪音可能对这一应用构成严 重的障碍，因为它另致分离出常常相当大一部分对选择的HLA-肽复合 物不反应的T淋巴细胞。Salter等(2)显示，当HLA在a 3结构域中带有一突变时，具有 CD8 a a共同受体的转染细胞所表达膜HLA的结合将改变。本专利技术人的研究证实，可溶性突变四聚体结合CD8的效力降低， 无论该CD8是a a或a p及是否与T淋巴细胞表面的TCR结合，这表 现为背景噪音降低。由此人们会预计，突变引起的亲和力损失将导致对某些CD8依赖 性T淋巴细胞克隆特异性信号的全部或部分损失。关于这一点，Salter 等的文章表明， 一些CD8依赖性同种异体反应性克隆对突变HLA-A2 携带细胞丧失其细胞毒性而对其它的少有影响。因此这些突变四聚体可能只检测到一个多克隆细胞群中的一部分 反应性细胞(CD8依赖性小的)。但在本专利技术人用抗CD8抗体进行双标记试验中，用突变和天然四 聚体对多克隆细胞群的比较标记数出人意料地表明，突变的四聚体与 天然四聚体识别相同百分比的特异性细胞。另外，突变四聚体对CD8依赖性高的克隆和CD8依赖性低的克隆 的标记比较表明，用TCR表达强度报告的四聚体的结合效力相当。因此看来突变很大程度上降低了四聚体与CD8本身的结合，但对其与TCR-CD8复合物的结合的影响很小。本专利技术基于利用在突变(更一般地讲为改变)的HLA多聚体中证明 的特性，涉及作为新产品的如多聚体和其与抗原性肽的复合物。本专利技术还涉及这些分子检测和/或分离肽特异性CD8+ T淋巴细胞 群的应用。本专利技术还提供利用这种载有肽的分子检测和/或分离这种细胞群 的方法，特別是用于诊断和治疗领域。本专利技术的多聚体从I类MHC的重组蛋白类似物形成，其特征在于 这些蛋白含有I类MHC重链与T淋巴细胞CD8共同受体相互作用区中 的至少一个改变，其导致该重链和CD8间相互作用亲和力的減小、甚 至抑制。该相互作用区的改变更具体地涉及重链的a 3结构域。 这尤其涉及，与能结合所述CD8共同受体的天然重链相应结构域相比，a3结构域中的至少一个氨基酸的突变。例如可以举出HLA-A2分子的a 3结构域245位丙氨酸残基到缬氨酸残基的突变。这种改变还可以是至少一个氨基酸的化学<务饰和/或至少一个氨 基酸的缺失，这种改变视情况与一个或多个突变一起使用。本专利技术还涉及作为新产品的从上述多聚体和抗原性肽形成的复合物。在这些复合物中，多聚体尤其以四聚体的形式存在。根据本专利技术，这些复合物用于检测和/或分离特异性识别复合物中 抗原性肽的CD8+ T淋巴细胞群。上文所定义复合物的应用可以很大程度上降低非特异性结合的背 景噪音，而不改变特异性标记，另外还可以免除免疫荧光分析时同时 使用抗CD8抗体的必要。在一个优选的应用中，所述复合物被用于细胞分选方法中，如免 疫磁分选方法。Luxembourg等(5)报道了 一种在小鼠体内分离特异性T淋巴细胞5的免疫磁分选技术。该技术系基于利用包被有MHC-肽复合物的小珠系统(果蝇系统中 的产品；载有肽并经化学生物素化)。本专利技术还涉及一种从多克隆细胞群中检测和/或分离肽特异性 CD8+ T淋巴细胞群的方法。该检测方法的特征在于，它包括一将多克隆细胞群与如上定义的复合了抗原性肽的多聚体在允许改 性I类MHC/肽复合物和对所述复合物有亲和力的T淋巴细胞受体间相 作用的条件下接触，一显示与所述复合物结合的淋巴细胞群。所述显示是通过例如荧光实现的，即利用带荧光成分的多聚体。从多克隆细胞群分离肽特异性淋巴细胞群的方法也属于本专利技术的 范围，并可以视情况在上述检测步骤之后进行。本方法利用免疫磁分选技术，其特征在于它包括一将多克隆细胞群与其上固定有上述定义的肽/I类MHC类似物复 合物的小磁珠在允许所述复合物和对这些复合物有亲和力的T淋巴细 胞的受体间相互作用的条件下接触，一回收结合的细胞群，如需要重复该分选搡作，和/或视情况随后一体外扩增所选择的细胞群。上述改性多聚体的背景噪音和特异标记间的差异增加使得能更好 地在多克隆细胞群中辨別特异性淋巴细胞群，从而使得利用这些多聚 体进行的免疫磁分选很有效。MHC分子在重链上包含例如酶生物素化基元。固定有所述复合物 的小珠与链霉抗生物素结合。所述多克隆细胞群来自从病人中取出的样品，例如滑液或外周血 单核细胞。所选细胞群的扩增步骤最好通过在不影响所扩增群体代表性的条 件下的多克隆刺激来实现。例如使用PHA、 IL2或照射的PBL。本专利技术还涉及经选择及视情况经扩增的T淋巴细胞群，其特本文档来自技高网...

【技术保护点】
从Ｉ类ＭＨＣ重组蛋白类似物制备的四聚体复合物，其特征在于所述蛋白在重链和Ｔ淋巴细胞的ＣＤ８共同受体相互作用的区域具有至少一个氨基酸取代，从而降低了所述重链与ＣＤ８相互作用的亲和力。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：F朗，M伯蒂尼尔，F达弗迪奥，M邦尼维勒，
申请(专利权)人：国家健康科学研究所，
类型：发明
国别省市：FR[法国]