本发明专利技术涉及层粘连蛋白用于使多能细胞分化成肝细胞谱系细胞的用途，具体而言，涉及层粘连蛋白(LN)作为肝分化基质的用途。本发明专利技术也涉及利用LN由人多能细胞群体诱导肝分化的方法。本发明专利技术还涉及通过本发明专利技术的方法得到的人成肝细胞样细胞群体或人胚胎肝细胞样细胞。本发明专利技术还涉及用于治疗人体的方法中的人成肝细胞样细胞群体，其表达HNF4α且基本上表达AFP。
【技术实现步骤摘要】
层粘连蛋白用于使多能细胞分化成肝细胞谱系细胞的用途本申请是申请号为201680010458.2，申请日为2016年2月19日，专利技术名称为“层粘连蛋白用于使多能细胞分化成肝细胞谱系细胞的用途”的中国专利申请的分案申请。
本专利技术涉及细胞分化和细胞疗法的领域。
技术介绍
自它们的发现以来，人诱导的多能细胞(hiPSC)和人胚胎干细胞(hESC)已经作为用于替代患病细胞的、身体的任何专门细胞的可再生来源进行了集中研究[1,2]。已经预见到它们用于治疗宽范围的疾病，诸如严重的心脏病[3]、神经学疾病[4]、肝病[5]和视网膜疾病[6]以及糖尿病[7,8]。肝病影响全世界数百万人。迄今为止，当患者具有严重代谢性肝障碍时，肝移植是唯一治愈选项。约37,000位患者处于欧洲和美国的肝移植的等候名单上。在欧洲每年进行超过5500例肝移植，并且遗传性代谢疾病占所述适应症的26％(欧洲肝移植登记)。但是，每年小于1/3的在肝等候名单上的患者可以接受肝移植，并且由于供体器官的短缺，在处于肝移植的等候名单上期间死亡的患者的数目(约10％)已经在近年增加。在过去的15年中，从尸体肝分离的肝细胞向患者的肝中的移植已经作为肝移植的临床替代方案出现[9,10]，特别是对于这样的天生代谢疾病：其中肝功能得到维持并且存在单一酶缺陷。在具有1型Crigler-Najjar(CN1)的患者中首次证实了移植的人肝细胞的代谢功能的确凿证据[11]。细胞移植以后，患者的临床状态和生活质量得到改善，5％UGT1A1活性的恢复导致胆红素血症和光疗治疗的50％下降。该有潜力的研究打开了用于治疗超过40位受遗传性代谢肝病影响的患者的途径，所述患者主要具有CN1和尿素循环障碍，但是也具有1型糖原贮积病、婴儿雷弗素姆病、进行性2型家族性肝内胆汁淤积和VII型血友病[9]。肝细胞移植允许一些儿童在等待肝移植时避免新的神经学损伤。相对少量的输入肝细胞(1.5-2x109个细胞)足以改善一些受影响的患者的代谢缺乏。但是，持久的稳定效应当然需要重复的细胞输注[12]。对于它在临床实践中的一般和常规应用，该方案具有其它重要限制。可得到的肝移植物会将肝移植区分优先次序，仅具有边缘质量的那些被用于肝细胞分离。由此，分离的肝细胞具有可变的质量和数量。它们快速地分化，并且不可在培养物中繁殖，且不会较好地耐受冷冻保存。共同地，这些限制强调了探究功能性人肝细胞的其它来源的需要。近年来，几个研究组报道了hESC和hiPSC向肝细胞样细胞(HLC)的体外分化，其中使用模仿肝胚胎发育阶段的不同培养条件[5,13-21]。HLC没有表现出完全成熟肝细胞的功能，但是具有更接近胚胎人肝细胞的表型，表达例如AFP[22]。它们可以移入、在某种程度上繁殖并在移植进免疫受损的动物的肝脏中以后维持肝功能性，所述动物经过化学损伤、照射或遗传操作以给移植的肝细胞提供选择性生长优势，诸如过表达尿激酶型纤溶酶原激活物以诱导组成性受体肝损伤和再生刺激的小鼠[5,14,17,23-25,60]。一些研究探究了HLC的治疗潜力并成功地治疗了化学诱导的致命性肝功能衰竭的多个鼠模型[26-33]。尽管如此，所述肝具有从内源性肝细胞再生它自身的惊人能力。由此，HLC对肝代谢功能的短暂支持足以从急性肝衰竭挽救回小鼠。相反，对于遗传性肝疾病的治疗，HLC必须在体内充分分化且具有长期功能以在患病的动物中表达缺失的成熟肝代谢功能。到目前为止，尚未证实将人遗传性肝病模型化的动物的成功代谢校正，在所述动物中，移植的HLC在受体肝中不具有选择性的存活和生长优势。耿氏大鼠(CN1的动物)具有在UGT1A1中的天然突变，从而在出生后不久造成UGT1A1活性的完全丧失和高胆红素血症。胆红素缀合物在胆汁中的完全缺失会提供容易的、明确的和灵敏的读出来评价UGT1A1活性的恢复。因而，耿氏大鼠构成宝贵的且方便的模型来跟踪体内肝细胞成熟和移植的肝细胞的治疗潜力。如在CN1患者中一样，肝细胞移植以后UGT1A1活性的部分恢复会导致显著的代谢校正[37-39]。在考虑HLC用于临床应用之前，一个关键问题也是使用符合GMP(良好生产规范)的肝分化方案生产它们。当前的肝分化方案通常含有饲养细胞-条件培养基、血清、动物起源的基质(诸如MatrigelTM)、小鼠饲养细胞、用于改善肝分化的病毒载体，或在GMP中不可得到的小分子[15,34-36]。它们都是使得到的组织不适合将来的临床应用的未知因子的来源。因此，对用于同种异体细胞疗法的人肝细胞存在临床需要。多能干细胞已经作为可移植的HLC的可再生来源进行了集中探究。但是，仍然有待证实在移植的细胞相对于固有的啮齿动物肝细胞没有任何选择性生长优势的情况下HLC可以治疗遗传性代谢肝病。另外，使用使它们不适合用于临床应用的方案生产了以前产生的HLC。近年来，诸如层粘连蛋白-521(LN-521)和层粘连蛋白-111(LN-111)的层粘连蛋白已经被描述为用于细胞培养的有关基质，更具体地用于维持目标细胞(诸如多能细胞或HLC)的长期体外培养物的功能性质，但是从未公开也没有提示层粘连蛋白可用于诱导和/或改善肝分化。另外，没有研究提示单独采用的层粘连蛋白基质可以支持从多能干细胞系的起始和随后的肝细胞分化。因而，国际专利申请WO2012/080844涉及层粘连蛋白-521的新用途。实际上，层粘连蛋白-521可以维持干细胞体外多能性，实现自我更新，并实现人胚胎干细胞的单细胞存活。当在没有分化抑制剂或饲养细胞存在下在用重组层粘连蛋白-521包被的平板上培养多能人胚胎干细胞时，所述胚胎干细胞增殖并维持它们的多能性。此外，已经证实，人成肝细胞样细胞可以首先从Matrigel包被的盘上的多能细胞产生(肝分化的诱导)，并然后在层粘连蛋白-111包被的盘上培养用于繁殖它们超过3个月，同时保持分化成肝细胞样细胞和胆管细胞(cholangiocyte)样细胞的潜能[36]。令人惊奇地，申请人发现了LN-111和LN-521在肝细胞样细胞分化中的新作用。LN-521的该新作用不同于在WO2012/080844中描述的多能性维持的作用。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术涉及层粘连蛋白(LN)作为肝分化基质的用途。在第二方面，本专利技术涉及LN用于诱导和/或改善多能细胞群体或多潜能细胞群体或确定内胚层(DE)细胞群体向肝细胞谱系细胞群体的分化的用途。在第三方面，本专利技术涉及一种诱导人肝分化的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人DE细胞群体，和(ii)在肝诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人成肝细胞样细胞群体，和(iii)任选地在肝成熟培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述人成肝细胞样细胞群体以产生人胚胎肝细胞样细胞群体。在第四方面，本专利技术涉及一种诱导肝分化的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供人多能细胞群体，(ii)在内胚层诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述群体以产生人D本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.层粘连蛋白(LN)作为肝分化基质的用途。/n
【技术特征摘要】
20150220 EP 15305265.91.层粘连蛋白(LN)作为肝分化基质的用途。
2.LN用于诱导和/或改善多能细胞群体、多潜能细胞群体或确定内胚层(DE)细胞群体分化成肝细胞谱系细胞群体的用途。
3.一种诱导人肝分化的方法，所述方法包括下述步骤：
(i)提供人确定内胚层(DE)细胞群体，和
(ii)在肝诱导培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养人DE细胞群体以产生人成肝细胞样细胞群体，和
(iii)任选地在肝成熟培养基中、在用层粘连蛋白包被的支持物上培养所述人成肝细胞样细胞群体以产生肝细胞样细胞群体，优选人胚胎肝细胞样细胞。
4.一种诱导肝分化的方法，所述方法包括下述步骤:
(i)提供人多能细胞群体，
【专利技术属性】
技术研发人员：T·H·阮，A·福尔埃，
申请(专利权)人：国家健康科学研究所，南斯大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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