一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及细胞培养领域，具体公开了一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用，主要包含以下步骤：1)人真皮成纤维细胞的分离及培养；2)人真皮成纤维细胞纯化：利用真皮成纤维细胞和表皮角质细胞对胰酶敏感性的差异，用0.05％胰酶/EDTA消化原代培养细胞1‑2分钟，消化下来的为真皮成纤维细胞。用此方法将细胞传代至第三代，可得到纯度为100％的真皮成纤维细胞；3)真皮成纤维细胞体外热损伤模型的构建：将接种有真皮成纤维细胞的培养板放置于37℃水浴锅中，热处理50分钟，可得到真皮成纤维细胞热损伤模型。

【技术实现步骤摘要】
一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用
本专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用。
技术介绍
皮肤作为人体最大的器官，是人体与外界接触的第一道天然屏障，发挥着调节人体温度、提供感觉、维持内环境稳定、阻止微生物、化学物质进入以及避免脱水等作用。正常的皮肤组织分为表皮层、真皮层和皮下组织层。真皮是由成纤维细胞、细胞外基质、血管内皮细胞和皮肤附属物(毛囊、汗腺)组成的结缔组织。真皮成纤维细胞(Dermalfibroblasts,DFL)分泌胶原蛋白和弹性蛋白分子，为皮肤提供机械强度和弹性。烧烫伤主要是指由于热力、热液、放射线、电能、化学物质等引起的皮肤、黏膜甚至皮下组织的损伤。烧烫伤可以导致皮肤失去完整结构、丧失功能、破坏人体内环境、在受到辐射及创伤的情况下容易发生感染，是导致人类死亡的一个重要因素。在我国，每年大概有2000万人遭受不同程度的烧烫伤，发病率约为1.5％～2％，其中大概有5％的人需要住院治疗。皮肤损伤修复是指皮肤受到不同程度的破坏和缺损时，机体通过再生、重建进行修复的一系列病理和生理过程，涉及到出血、凝固、炎症的发生发展、细胞迁移、增殖和分化、血管再生、细胞外机制的合成和重塑等，是一个动态和复杂的生物学过程。皮肤损伤修复一般可以概括为炎症期、组织细胞增殖期和组织结构重塑期这三个独特而又重叠的阶段。早在1996年，Lekic等人就提出了“真皮成纤维细胞是皮肤创面修复的工程师、建筑师和管理员”的观点。当皮肤组织受到损伤时，DFL可以通过增殖、迁移、分化、分泌多种细胞因子以及合成包括胶原蛋白在内的多种细胞外基质等方式来促进皮肤创面愈合。皮肤损伤后，DFL首先会以有丝分裂的方式大量增殖。损伤后4～5天，DFL开始和合成分泌细胞外基质成分(以胶原蛋白为主)和多种细胞因子。这些胞外基质和细胞因子与新生薄壁毛细血管功能形成肉芽组织，填满伤口，为创面愈合过程中细胞的增殖、分化、生长、黏附提供支撑结构因此，任何改变DFL增殖、迁移、生物学状态及功能的因素都会影响皮肤损伤修复。因此，在现有的研究中大量用到皮肤成纤维细胞进行实验。到目前为止，在皮肤损伤相关研究中，往往用真皮成纤维细胞的细胞系进行研究。但是，细胞系由于长期在体外2D培养，细胞在形态和功能上与体内成纤维细胞相差甚远，导致获取的实验结果不可信。而现有的原代真皮成纤维细胞的分离、培养方法又存在细胞得率低、往往含有其它类型细胞污染、细胞增殖能力弱等缺点，极大的限制了其应用。因此，本申请提出一种简单、高效的人真皮成纤维细胞分离、培养及纯化的方法。此外，为了模拟体内皮肤细胞烧伤及烫伤，我们通过热水处理，构建了一种人真皮成纤维细胞热损伤的模型。
技术实现思路
针对现有技术的上述不足之处，本专利技术的目的是提供一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种从小孩包皮切除手术废弃皮肤中分离、培养、纯化真皮成纤维细胞的方法、并利用水浴锅加热处理构建了人真皮成纤维细胞人损伤模型。本专利技术的目的之一是提供一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，包括以下步骤：1)将生长状态良好的高纯度真皮成纤维细胞胰酶消化，当显微镜下见细胞为单个圆形时终止消化，进行离心并用PBS清洗获得细胞沉淀；2)将步骤1)所述的细胞沉淀接种于六孔板，加入真皮成纤维细胞完全培养基进行培养；3)细胞贴壁之后吸弃培养基，去除未贴壁细胞，添加新鲜真皮成纤维细胞完全培养基，将六孔板于53℃水浴中热处理50分钟，得到真皮成纤维细胞热损伤模型。在优选地的实施方案中，步骤1)所述高纯度真皮成纤维细胞的纯度大于95％；更优选地，所述高纯度真皮成纤维细胞的纯度为100％。在优选地的实施方案中，步骤1)所述终止消化的方法为用含体积浓度5％-15％胎牛血清的DMEM培养基处理细胞，优选地，采用10％胎牛血清的DMEM培养基处理细胞。在优选地的实施方案中，所述真皮成纤维细胞完全培养基具有如下体积份数的各组分：30-35份的H-DMEM基础培养基、5-7份的胎牛血清和0.3-0.5份的双抗溶液；更优选地，所述真皮成纤维细胞完全培养基具有如下体积份数的各组分：33.6份的H-DMEM基础培养基、6份15％v/v胎牛血清以及0.4份1％v/v双抗溶液，所述双抗溶液含10,000U/ml苄青霉素钠和10,000μg/ml链霉素。在具体的实施方式中，该真皮成纤维细胞完全培养基按以下方法制备：所述真皮成纤维细胞完全培养基的制备方法为：在50mL无菌容器中加入33.6mLH-DMEM基础培养基、6mL胎牛血清和0.4mL双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)，(1％v/v)。充分混匀，4℃保存待用。在优选地的实施方案中，所述培养的条件为，在六孔板中每孔添加2ml真皮成纤维细胞完全培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养，培养时间为24h。在优选地的实施方案中，步骤2)所述细胞沉淀在六孔板上的接种细胞密度为1.5×105个/孔。在优选地的实施方案中，步骤1)所述高纯度真皮成纤维细胞的制备为以人包皮作为细胞来源，进行分离培养后再进行细胞传代和纯化获得。在优选地的实施方案中，所述分离培养包括如下步骤：A.包皮组织的收集将500ml蓝盖瓶送至手术房，蓝盖瓶预先装有200mLHank’s平衡盐溶液作为采集液；儿童进行包皮切除手术之后，将皮肤组织放入上述采集液中，0-4℃条件下进行保存24-48h；B.分离真皮组织于实验室无菌超净台中取出皮肤组织，PBS清洗3次，每次3min；将皮肤组织置于无菌培养皿中，用眼科剪及眼科镊仔细去除皮下脂肪组织、血管及系膜；用PBS清洗剩余皮肤组织1次后，加入0.25％Dispase中性蛋白酶，4℃冰箱中消化过夜；第二天取出皮肤组织，PBS漂洗3次去除中性蛋白酶溶液，终止消化；用眼科镊分别夹住皮肤的真皮组织及表皮组织，将表皮从真皮组织上剥离，真皮组织放入PBS中漂洗3次；C、真皮成纤维细胞原代培养：用眼科剪将真皮组织充分剪碎，使得真皮组织的直径不超过1cm；用眼科镊仔细的将真皮组织逐块夹起，滤干水分，将其均匀展开贴放在六孔板的底部：将六孔板放入37℃孵育箱中，倒置贴壁；1h后，在六孔板中加入1mL真皮成纤维细胞完全培养基，轻柔的将六孔板放入37℃孵育箱中进行培养；1-2天后，待组织块完全贴牢在六孔板底部之后，每个六孔板中补加1mL真皮成纤维细胞完全培养基；真皮组织块贴壁培养3-5天后，可以观察到有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞增殖到一定密度后对细胞进行传代；所述Hank’s平衡盐溶液的制备方法如下：在200ml的Hank’s平衡盐溶液中添加以下成分至下述浓度：万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)将生长状态良好的高纯度真皮成纤维细胞胰酶消化，当显微镜下见细胞为单个圆形时终止消化，进行离心并用PBS清洗获得细胞沉淀；/n2)将步骤1)所述的细胞沉淀接种于六孔板，加入真皮成纤维细胞完全培养基进行培养；/n3)细胞贴壁之后吸弃培养基，去除未贴壁细胞，添加新鲜真皮成纤维细胞完全培养基，将六孔板于53℃水浴中热处理50分钟，得到真皮成纤维细胞热损伤模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将生长状态良好的高纯度真皮成纤维细胞胰酶消化，当显微镜下见细胞为单个圆形时终止消化，进行离心并用PBS清洗获得细胞沉淀；
2)将步骤1)所述的细胞沉淀接种于六孔板，加入真皮成纤维细胞完全培养基进行培养；
3)细胞贴壁之后吸弃培养基，去除未贴壁细胞，添加新鲜真皮成纤维细胞完全培养基，将六孔板于53℃水浴中热处理50分钟，得到真皮成纤维细胞热损伤模型。


2.根据权利要求1所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，所述真皮成纤维细胞完全培养基具有如下体积份数的各组分：
30-35份的H-DMEM基础培养基、5-7份的胎牛血清和0.3-0.5份的双抗溶液；
优选地，所述真皮成纤维细胞完全培养基具有如下体积份数的各组分：
33.6份的H-DMEM基础培养基、6份15％v/v胎牛血清以及0.4份1％v/v双抗溶液，所述双抗溶液含10,000U/ml苄青霉素钠和10,000μg/ml链霉素。


3.根据权利要求1或2所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，所述培养的条件为，在六孔板中每孔添加2ml真皮成纤维细胞完全培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养，培养时间为24h。


4.根据权利要求1所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤1)所述高纯度真皮成纤维细胞的纯度大于95％；优选地，所述高纯度真皮成纤维细胞的纯度为100％。


5.根据权利要求1所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤1)所述终止消化的方法为用含体积浓度5％-15％胎牛血清的DMEM培养基处理细胞，优选地，采用10％胎牛血清的DMEM培养基处理细胞。


6.根据权利要求1所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤2)所述细胞沉淀在六孔板上的接种细胞密度为1.5×105个/孔。


7.根据权利要求1所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，步骤1)所述高纯度真皮成纤维细胞的制备为以人包皮作为细胞来源，进行分离培养后再进行细胞传代和纯化获得。


8.根据权利要求7所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，其特征在于，所述分离培养包括如下步骤：
A.包皮组织的收集
将500ml蓝盖瓶送至手术房，蓝盖瓶预先装有200mLHank’s平衡盐溶液作为采集液；
儿童进行包皮切除手术之后，将皮肤组织放...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳全文，李婧嫄，辛洪波，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36