DNA免疫吸附剂的制备方法技术

本发明专利技术提供一种DNA免疫吸附剂的制备方法，通过将干燥的碳化树脂倒入到DNA包膜溶液中，搅拌、过滤、烘干，然后再加入乙醇或乙醇乙醚混合溶剂，搅拌、过滤、干燥、冷却，得到成品DNA免疫吸附剂。该方法采用“湿蚀”包膜法，在对吸附剂进行一次包膜后，再加入适当的有机溶剂部分溶解包膜溶液，从而将黏附于膜层表面的DNA“局部释放”，使溶解后的包膜溶液再次成膜，使包膜厚度更加均匀，从而达到提高DNA有效吸附率的效果。

【技术实现步骤摘要】
DNA免疫吸附剂的制备方法
本专利技术涉及血液净化领域，具体涉及一种碳化树脂DNA免疫吸附剂的制备方法。
技术介绍
系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,以下简称SLE)是一种常见的累及多系统多器官的自身免疫性疾病。由于患者机体免疫调节障碍及自身免疫耐受状态被打破，产生多种针对自身组织的抗体，导致组织和器官的损伤，这些抗体主要是抗Sm抗体、抗核抗体以及抗DNA抗体。其中抗DNA抗体可分为抗单链DNA抗体(抗ss-DNA抗体)和抗双链DNA抗体(抗ds-DNA抗体)。根据国内外临床及基础研究表明，抗ds-DNA抗体的滴度与疾病严重程度及活动性呈正相关。最近几年，激素及免疫抑制剂的应用使SLE患者的愈后效果得到明显改善，但依旧存在很多患者药物疗效不显著的现象，过度的免疫抑制治疗所引起的感染是引起SLE患者死亡的主要原因。另外，多方面研究证实，抗双链DNA抗体(抗ds-DNA抗体)与DNA结合成为免疫复合物在肾小球基底膜沉积，或ds-DNA抗体直接作用于肾小球抗原，从而造成SLE患者的肾损伤。使用DNA免疫吸附(IA)对患者进行血液灌流，是近二、三十年发展起来的新型疗法。Jones,FrankR(EP0272792A1,1987)对这种方法作了详细说明。DNA免疫吸附剂的吸附作用是依靠DNA对致病性抗ds-DNA抗体的特异识别作用，清除患者血液中的致病物质，缓解病情，改善患者的免疫功能，从而逐渐恢复健康。美国的TermanDS等人(Lancet,1979,2(8147):824-7)首次使用活性炭为载体材料，采用火棉胶包膜固定DNA，得到DNA免疫吸附剂用于血液灌流治疗一名重度SLE患者，使患者生命延长，从此开辟了DNA吸附剂治疗SLE的先河。使用火棉胶包膜，虽使DNA免疫吸附剂的安全有效性得到了保证，但吸附率仅为50％左右。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可提高DNA免疫吸附剂吸附率新的DNA免疫吸附剂的制备方法。本专利技术提供一种DNA免疫吸附剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一：吸附剂包膜步骤1.1将干燥的碳化树脂倒入到DNA包膜溶液中，搅拌、过滤、烘干，其中所述碳化树脂与所述DNA包膜溶液的体积比为1：(2-4)；步骤1.2向步骤1.1所得产物中加入有机溶剂，所述碳化树脂与所述有机溶剂的体积比为1：(0.5-1)，所述有机溶剂为乙醇或乙醇乙醚混合溶剂，所述乙醇乙醚混合溶剂中乙醇的体积百分比浓度至少为60％；步骤二：将步骤一所得产物搅拌、过滤、干燥、冷却，得到成品DNA免疫吸附剂。上述方法采用“湿蚀”包膜法，在对吸附剂进行一次包膜后，再加入适当的有机溶剂部分溶解包膜溶液，从而将黏附于膜层表面的DNA“局部释放”，使溶解后的包膜溶液再次成膜，使包膜厚度更加均匀，固定DNA，从而达到提高DNA有效吸附率的效果。其中，有机溶剂可以是乙醇或乙醇乙醚混合溶剂。当有机溶剂为乙醇乙醚混合溶剂时，混合溶剂中乙醇优选的体积百分比浓度为不低于60％。更为优选的，有机溶剂为乙醇乙醚混合溶剂，其中乙醇的体积百分比浓度为70％-90％，此种情况下，吸附率可达90％。更好的方案是步骤一中的DNA包膜溶液通过包含以下步骤的方法配制：步骤A向浓度为1-2mg/ml的DNA原液中加入相当于DNA质量的0.1％-2％的氨基酸和与DNA原液等体积的无水乙醇，搅拌或振荡至完全溶解，得DNA溶液；步骤B将步骤A所得DNA溶液与0.5％-1％质量浓度的火棉胶溶液按体积比(0.25-0.5)：1充分混合，得DNA包膜溶液。再好的方案是步骤A中所述氨基酸为极性氨基酸，选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸中的一种或多种。更优选的是甘氨酸。氨基酸可提高DNA在水中的溶解性，因此在包膜溶液加入一定量的氨基酸，可以改善DNA的溶解性能，达到均相溶液的效果。其中，甘氨酸是一种人体必需氨基酸，基本无毒副作用，同时，甘氨酸还可以大大提高水溶液的介电常数，从而提高DNA在水中的溶解性。另一较好的技术方案步骤一中的碳化树脂通过聚合制得，在聚合时，向聚合体系中加入纳米粒子作为模板剂。通过将作为模板剂的纳米粒子加入到制备大孔吸附树脂的共聚反应体系中，可使制备出的富含纳米中孔的吸附树脂。将树脂在马弗炉中碳化后，对树脂进行酸充分去除模板剂，即可制备出富含纳米中孔孔径可控的碳化树脂。再一较好的技术方案是步骤一中的炭化树脂通过包含以下步骤的方法制得：步骤a制备出聚苯乙烯树脂向由水相和油相构成的混合体系中加入引发剂、纳米模板剂，缓慢升温至95℃-100℃反应3-5小时，经过滤、洗涤处理后，制备出聚苯乙烯树脂；其中，所述水相是质量浓度为0.5％-5％的明胶水溶液；所述油相为苯乙烯和二乙烯苯的混合单体，所述二乙烯苯占混合单体总质量的0.5-1.5％；水相和油相体积比为(3-4)：1；所述引发剂的用量为混合单体总质量的1-3％，所述纳米模板剂的用量占混合单体总质量的0.5-1％；步骤b碳化树脂的制备在电阻炉中加入步骤a制得的聚苯乙烯树脂，在氮气保护下逐渐升温，以80-100℃每小时的升温速度升到800-1000℃，水蒸气活化1-2小时；用1-3mol/LHCl水溶液煮沸0.5-1小时，用蒸馏水洗至中性，得碳化树脂。较为优选的方案是，纳米粒子为纳米碳酸盐或纳米氢氧化物。更为优选的纳米粒子可以是纳米CaCO3、MgCO3、BaCO3、SrCO3、ZnCO3、Mg(OH)2、Bi(OH)3、Fe(OH)3、Ti(OH)3、Cd(OH)2、Co(OH)2、Cr(OH)3、Mn(OH)2中的任一一种或多种。再优选的是，纳米粒子的粒径为2-50nm。本专利技术对上述方法中的引发剂没有严格的限制，其中步骤a中的引发剂可以是过氧化苯甲酰，步骤b中的引发剂可以为PBO。本专利技术对上述方法中的DNA原液的配制方法没有严格的际制，可采用现有技术中配制DNA原液的方法，如：将高纯度小牛胸腺DNA(DNA纯度85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)缓冲溶液中，配制浓度为DNA浓度为1-2mg/mlDAN原液。本专利技术以上及以下所提及的温度，均指摄氏温度。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进一步说明。实施例1制备样品编号为1号的DNA免疫吸附剂量取一定体积的干燥碳化树脂，倒入到体积为碳化树脂2倍的包膜溶液中，搅拌5min然后过滤，将过滤后的树脂放在60℃下烘干2小时左右，冷却后即制得一次包膜的DNA免疫吸附剂。上述过程中使用的包膜液和碳化树脂分别通过以下方法制得。一、包膜液的制备：取高纯度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)缓冲溶液中，配制浓度为2mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入等体积的无水乙醇，搅拌或振荡至完全溶解，即为DNA溶液。将DNA溶液与1％火棉胶溶液按体积比0.25：1充分混合，得到包膜液。二、碳化树脂的制备步骤a制备聚苯乙烯树脂在常温下，将明胶溶解于水中，配成0.5％的反应水相，加热到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合单体为反应油相，其中二乙烯苯占混合单体总质量的0.5％。将水相和油相按体积比为3：1混合，向体系中加入过氧化苯甲酰为引发剂，加入粒径本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA免疫吸附剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：吸附剂包膜步骤1.1将干燥的碳化树脂倒入到DNA包膜溶液中，搅拌、过滤、烘干，其中所述碳化树脂与所述DNA包膜溶液的体积比为1：(2‑4)；步骤1.2向步骤1.1所得产物中加入有机溶剂，所述碳化树脂与所述有机溶剂的体积比为1：(0.5‑1)，所述有机溶剂为乙醇或乙醇乙醚混合溶剂，所述乙醇乙醚混合溶剂中乙醇的体积百分比浓度至少为60％；步骤二：将步骤一所得产物搅拌、过滤、干燥、冷却，得到成品DNA免疫吸附剂。

【技术特征摘要】
2016.12.07 CN 20161111291571.DNA免疫吸附剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：吸附剂包膜步骤1.1将干燥的碳化树脂倒入到DNA包膜溶液中，搅拌、过滤、烘干，其中所述碳化树脂与所述DNA包膜溶液的体积比为1：(2-4)；步骤1.2向步骤1.1所得产物中加入有机溶剂，所述碳化树脂与所述有机溶剂的体积比为1：(0.5-1)，所述有机溶剂为乙醇或乙醇乙醚混合溶剂，所述乙醇乙醚混合溶剂中乙醇的体积百分比浓度至少为60％；步骤二：将步骤一所得产物搅拌、过滤、干燥、冷却，得到成品DNA免疫吸附剂。2.根据权利要求1所述的DNA免疫吸附剂的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为乙醇乙醚混合溶剂，所述乙醇乙醚混合溶剂中乙醇的体积百分比浓度为70％-90％。3.根据权利要求2所述的DNA免疫吸附剂的制备方法，其特征在于：所述步骤一中的DNA包膜溶液通过包含以下步骤的方法配制：步骤A向浓度为1-2mg/ml的DNA原液中加入相当于DNA质量的0.1％-2％的氨基酸和与DNA原液等体积的无水乙醇，搅拌或振荡至完全溶解，得DNA溶液；步骤B将步骤A所得DNA溶液与0.5％-1％质量浓度的火棉胶溶液按体积比(0.25-0.5)：1充分混合，得DNA包膜溶液。4.根据权利要求3所述的DNA免疫吸附剂的制备方法，其特征在于：所述步骤A中所述氨基酸为极性氨基酸，选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸中的一种或多种。5.根据权利要求3所述的DNA免疫吸附剂的制备方法，其特征在于：所述步骤A中所述氨基酸为甘氨酸。6.根据权利要求2所述的DNA免疫吸附剂的制备方法，其特征在于：所述步骤一中的DNA包膜溶液通过包含以下步骤的方法配制：步骤A向浓度为1-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：董凡，谢高峰，黄杰辉，
申请(专利权)人：珠海健帆生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44