本发明专利技术涉及一种莱克多巴胺ＲＣＴ的检测方法，更确切地说它是利用免疫亲和层析柱及酶联免疫吸附方法来检测食品中的莱克多巴胺残留，属于免疫学和食品安全检测技术领域。本发明专利技术的方法是：首先通过合成免疫抗原，包被抗原，动物免疫，抗体纯化等步骤制备多克隆抗体，再将此抗体交联到琼脂糖凝胶上，制备免疫亲和层析柱。被检样品经处理后，通过亲和柱以富集其中的莱克多巴胺；收集亲和柱的洗脱液进行酶联免疫吸附检测，以确定其中的莱克多巴胺含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫分析
具体而言，涉及一种莱克多巴胺(RCT)亲和层析-酶联免疫检测方法及其专用检测试剂盒。
技术介绍
莱克多巴胺(Ractopamine)是β2-肾上腺素能激动剂(BAA)成员之一，与“瘦肉精”同属儿茶酚胺类(肾上腺素和去甲肾上腺素BAA)物质。早在本世纪50年代末期就发现，儿茶酚胺类(肾上腺素和去甲肾上腺素)能刺激脂肪组织释放脂肪酸，并增加蛋白质沉积，但直到70年代初期，儿茶酚胺类物质及其类似物改善机体营养调配和胴体组成的能力，才首先由美国氰胺公司研究部所认识。随后便大规模用于畜禽生产以提高瘦肉率，减少脂肪沉积，及增加产奶量等。BAA用作营养重分配剂的实用性开发研究始于70年代末期。二十几年来，以美国几家大公司和研究室为首，已开发出数百种结构类似药，经过对大鼠、牛、绵羊、猪、禽等的数百次逾万头(只)动物试验，筛选出促生长作用较强的BAA十余种。其中实用型BAA有莱克多巴胺(ractopamine)、克仑特罗(clenbuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、赛曼特罗(cimaterol)、吡啶甲醇类、脱脂BAA。其中菜克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇因其口服效率高在生产中常用。据Kuiper(1998)综述，1989年，西班牙中部发生135人因食用含β2-肾上腺素能激动剂残留物的牛肝而集体中毒的事件；1992年西班牙北部又有232人因同样原因而集体中毒；1995年西班牙的巴塞罗那地区发生15起β2-肾上腺素能激动剂中毒事件；1990-1991年，法国里昂地区有8个家庭因食用残留β2-肾上腺素能激动剂的牛肝而集体中毒；1996年，仅意大利就发生62起因食用残留有β2-肾上腺素能激动剂的牛肉和牛肝而集体中毒的事件；中毒症状有肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、肌肉疼、目晕、恶心、呕吐、发烧、战栗。进食40小时后病人尿中仍可检出β2-肾上腺素能激动剂。有心脏病史的人对食物残留β2-肾上腺素能激动剂尤为敏感(尹靖东等，1998)。因此欧盟采取了严密的措施，通过一系列法规条例严格控制莱克多巴胺、克仑特罗进入市场。除特殊情况外任何动物体内有β2-肾上腺素能激动剂残留都是违法的。目前许多国家对莱克多巴胺提出了最高残留限量，如英国在动物可食性组织的最大残留量为0.5ng/g，荷兰规定肝组织最大残留量为1ng/g(G.A.Mitchell，et al，1998)。而我国也规定为1ng/g(肝组织)或1ng/ml(尿液)。我国农业部1997年3月3号文严令禁止β2-肾上腺素能激动剂在动物生产中的应用。但由于资金、技术等方面的原因，滥用β2-肾上腺素能激动剂的行为一直未能得到有效的遏止，2001年，连续发生了广东河源、广东信宜、浙江等地十几起上百人集体中毒的事件。因此，需建立一种灵敏、特异、操作简单、适于大批量样品筛选的检测方法，才能对莱克多巴胺、克仑特罗类物质的非法使用进行及时、有效的监测。目前的检测方法主要有高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)。这些仪器分析技术一般耗时，价贵，大批量检测困难，操作繁琐，均不能适应市场监督需要快速、简便、价廉的要求。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种样品前处理简单，灵敏度高，特异性强，快速高效，适于大批量样品筛选的莱克多巴胺检测方法，并开发结构简单，使用方便，价格便宜，便于携带的莱克多巴胺检测试剂盒。专利技术人主要采用亲和层析-酶联免疫吸附方法(IAC-ELISA)检测RCT；先利用免疫亲和层析方法将检测样品中的RCT加以富集纯化，再通过酶联免疫吸附方法对其进行定量检测；完成了本专利技术。本专利技术提供了一种利用免疫亲和层析和酶联免疫吸附检测样品中莱克多巴胺RCT的方法，包括步骤(1)样品前处理；(2)制备酶标抗原将活化的辣根过氧化物酶与纯化的RCT混合，制备酶标抗原；(3)制备RCT抗体；(4)制备偶联RCT抗体的凝胶；(5)包被酶标板；(6)免疫亲和层析纯化将偶联抗体的凝胶装柱，加入样品过柱，洗脱，收集洗脱液；(7)酶联免疫吸附检测将洗脱液加入经抗体包被的酶标板上，温育后洗涤拍干；加入酶标抗原，温育后洗涤拍干；显色、终止；用酶标仪读取OD值；(8)绘制标准曲线；(9)根据标准曲线对洗脱液中的RCT含量进行定量计算。优选地，样品前处理采用称取动物制品，加入HCl匀浆，冻融，离心取上清，加入NaOH调解pH值至11，加入异丁醇，振荡，静置，定量吸取异丁醇，水浴蒸干，再加入磷酸盐溶液溶解析出物，冻存待测；或取动物尿液，离心去除杂质，取上清待测。优选地，制备酶标抗原采用将活化的辣根过氧化物酶与纯化的RCT混合，在碳酸缓冲体系中进行标记反应，之后加入硼氢化钠还原未结合位点；其中制备RCT抗体采用将RCT与牛血清白蛋白BSA或与卵清白蛋白OVA偶联作为抗原，制备多克隆RCT抗体或单克隆RCT抗体。优选地，制备多克隆RCT抗体的方法采用将新西兰白兔接种免疫，免疫抗原为BSA-RCT或OVA-RCT，放血；分级沉淀血清中杂蛋白和抗体免疫球蛋白，离心后得含有多克隆RCT抗体的溶液，冻存备用。优选地，制备单克隆RCT抗体的方法采用将小鼠接种免疫，免疫抗原为BSA-RCT或OVA-RCT，采血，测定抗体效价，取脾细胞；将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；筛选杂交瘤细胞，获得完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；在小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞，采集腹水，经提纯后待用。优选地，制备偶联RCT抗体的凝胶采用先活化凝胶；将活化后的凝胶与RCT抗体振荡混匀；离心洗涤以洗脱杂蛋白和未结合的抗体；依次用不同pH梯度溶液轮流洗涤封闭未结合的活性基团，再用磷酸缓冲液淋洗，冷藏保存备用。优选地，包被酶标板采用将RCT抗体包被在酶标板上，冷藏过夜；洗涤拍干。优选地，免疫亲和层析纯化采用将偶联抗体的凝胶装柱，加入样品，循环过柱，用甘氨酸溶液洗脱，收集洗脱液。优选地，酶联免疫吸附检测采用将样品洗脱液加在包被后的酶标板上，温育后洗涤拍干；加入酶标抗原，温育后洗涤拍干；继而加入底物混合液显色；终止反应；用酶标仪读取OD值。本专利技术还提供了一种用于所述方法的试剂盒，其特征在于它包括A试剂标准RCT试剂；C试剂酶标抗原试剂；K试剂偶联RCT抗体的凝胶；包被RCT抗体的酶标板。优选地，所述的试剂盒还包括B试剂稀释液； D试剂酶标抗原稀释液E试剂含吐温-20的磷酸盐PBS固体；F试剂邻苯二胺试剂；G试剂醋酸钠-柠檬酸缓冲液；H试剂30％H2O2；I试剂硫酸溶液；J试剂甘氨酸溶液。本专利技术技术方案详述如下1、样品前处理动物制品(包括肝、肺、心、肾、肌肉)称取10g，加入50ml 0.1mol/LHCl进行组织匀浆，冻融两次，离心取上清，用10mol/L NaOH调节pH值到11，再加入异丁醇30ml，振荡30min，静置4h，定量吸取异丁醇，水浴蒸干，再加入1ml磷酸盐溶液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)溶解析出物，冻存待测；动物尿样，离心去除杂质后，取上清待测。2、制备酶标抗原将活化的辣根过氧化物酶与纯化的RCT混合，在碳酸缓冲体系中进行标记反应，之后加入硼氢化钠还原未结合位点；3、制备RCT抗体将RCT与牛血清白蛋白BSA或与卵清白蛋白OVA偶联作为抗原，制备本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用免疫亲和层析和酶联免疫吸附检测样品中莱克多巴胺ＲＣＴ的方法，包括步骤：（１）样品前处理；（２）制备酶标抗原：将活化的辣根过氧化物酶与纯化的ＲＣＴ混合，制备酶标抗原；（３）制备ＲＣＴ抗体；（４）制备偶联 ＲＣＴ抗体的凝胶；（５）包被酶标板；（６）免疫亲和层析纯化：将偶联抗体的凝胶装柱，加入样品过柱，洗脱，收集洗脱液；（７）酶联免疫吸附检测：将洗脱液加入经抗体包被的酶标板上，温育后洗涤拍干；加入酶标抗原，温育后洗涤拍干 ；显色、终止；用酶标仪读取ＯＤ值；（８）绘制标准曲线；（９）根据标准曲线对洗脱液中的ＲＣＴ含量进行定量计算。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄昆仑，许文涛，邓爱科，罗云波，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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