一种分离纯化卵磷脂和脑磷脂的方法技术

一种分离纯化卵磷脂和脑磷脂的方法，其特征是：以卵磷脂和脑磷脂为主成分的混合物为原料，其中卵磷脂和脑磷脂之和占混合物总重量的８０％以上，用３－２０ｕｍ的硅胶为固定相，体积比为８０∶２０－９９∶１的二氯甲烷和甲醇混合溶剂为流动相，溶于流动相溶剂的３０－４００ｍＭ的乙醇胺溶液为置换剂，采用高效液相色谱仪置换分离卵磷脂和脑磷脂，先用流动相平衡高效液相色谱仪，然后打开排液阀，改用置换剂替换掉排液阀前管路及泵中的流动相，然后关闭泵及排液阀，将进样阀旋至装样处，称取吸附剂重量的１－１５％的卵磷脂和脑磷脂混合物，溶解在０．５－２ｍＬ流动相溶剂中装样，调节流速为０．１－０．５ｍＬ／ｍｉｎ，将进样阀旋至进样处，并打开泵，将样品泵入色谱柱，置换分离，每０．１－１ｍＬ收集一次洗出液，分别合并含脑磷脂和卵磷脂的收集液，经真空脱溶、干燥后得到高纯卵磷脂和脑磷脂。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术系分离纯化技术，涉及。
技术介绍
置换色谱最早是由Tswett于1906年提出的，当时他发现在超载淋洗色谱中有样品的置换现象发生，但直至1943年Tiselius才明确定义色谱分离为前沿，淋洗和置换三种模式。置换色谱是一种非线性色谱模式，通常一个运行周期包括平衡，上样，置换，再生四个步骤。被选作置换剂的物质与固定相的作用力应比任何被分离样品组分与固定相的作用力都强，被分离样品在带置换剂的流动相推动下，样品各组分依照与固定相作用力的弱强依次逐步被置换剂置换分离形成一系列相毗邻的纯物质带，流出色谱柱。虽然置换色谱早已为人们所认识，但限于色谱仪器及填料的限制，应用主要集中在稀土元素和同位素的分离等领域。直到八十年代以后，随着高性能色谱仪和色谱填料的出现，置换色谱的应用才随之广泛起来，特别是在生物分子的分离与纯化方面。Horváth及其合作者们在这方面做出了重要的贡献，分离了氨基酸，肽，药物异构体，激素，抗生素，核苷酸等多种物质；Cramer等人在蛋白质及核酸的置换分离等方面也做了大量的研究工作；黄俊雄等人尝试了药物异构体真实样品的置换分离；Freitag等人对乳清蛋白在填充柱和整体柱上的置换分离进行了比较，还研究了阳离子交换置换色谱分离蛋白质时置换剂质量大小对分离效果的影响。置换色谱与淋洗色谱相比，具有样品负载量大，产品浓度高，拖尾小，耗用溶剂少，固定相利用率高等优点，因而特别适合于作为制备色谱分离。在相同的柱子上，处理样品量往往比淋洗色谱高出1-2个数量级。Horváth等人都曾在分析柱上成功的进行了置换制备分离。磷脂类化合物是细胞膜的重要组成成分，具有重要的生理功能。高纯的磷脂分级产品如卵磷脂和脑磷脂可广泛用于营养，医药及化妆品行业。但由于目前的高纯卵磷脂和脑磷脂多采用高效液相色谱(HPLC)淋洗模式制备，产品处理量小，溶剂消耗大，因而生产成本高，价格昂贵，从而限制了其应用。为了降低成本，许多学者进行了研究，如Kim等人尝试着从简化流动相这一角度出发，采用纯甲醇为流动相对蛋黄磷脂进行了分离，取得了一定的效果，但无法从根本上解决淋洗色谱所固有的缺陷。因此本专利技术的目的是想改变过去的色谱分离模式，采用适合于制备分离的置换色谱技术，从而从根本上解决这一难题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供，该方法样品负载量大、产品浓度高、拖尾小、耗用溶剂少、固定相利用率高。本专利技术提供的技术方案是以卵磷脂和脑磷脂为主成分的混合物为原料，其中卵磷脂和脑磷脂之和占混合物总重量的80％以上，用3-20um的硅胶为固定相，体积比为80∶20-99∶1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂为流动相，溶于流动相溶剂的30-400mM的乙醇胺溶液为置换剂，采用高效液相色谱仪置换分离卵磷脂和脑磷脂，先用流动相平衡高效液相色谱仪，然后打开排液阀，改用置换剂替换掉排液阀前管路及泵中的流动相，然后关闭泵及排液阀，将进样阀旋至装样(“Load”)处，称取吸附剂重量的1-15％的卵磷脂和脑磷脂混合物，溶解在0.5-2mL流动相溶剂中装样，调节流速为0.1-0.5mL/min，将进样阀旋至进样(“Injection”)处，并打开泵，将样品泵入色谱柱，置换分离，每0.1-1mL收集一次洗出液，分别合并含脑磷脂和卵磷脂的收集液，经真空脱溶、干燥后得到高纯卵磷脂和脑磷脂。上述以卵磷脂和脑磷脂为主成分的混合物为天然磷脂经常规方法预处理后，得到的以卵磷脂和脑磷脂为主成分的混合物，其中卵磷脂和脑磷脂之和占混合物总重量的80％以上。本专利技术也可以人工合成的卵磷脂和脑磷脂为主成分的混合物为原料，其中卵磷脂和脑磷脂之和占混合物总重量的80％以上。上述色谱柱长径比为20∶1-60∶1。进样阀为液相色谱用六通阀，所带进样环体积为0.5-2mL。收集完脑磷脂和卵磷脂的收集液后，改用再生剂二氯甲烷-甲醇-乙酸(50-90∶10-40∶5-15，V/V)，在大于1mL/min的流速下冲洗色谱柱，再用流动相重新平衡后进行下一次置换分离。与现有的制备方法相比，本专利技术采用的置换色谱技术具有样品负载量大、产品浓度高、拖尾小、耗用溶剂少、固定相利用率高等优点，从而可降低生产成本。具体实施例方式天然磷脂预处理可采用现有的方法。无论是通过何种方法如溶剂法、超临界二氧化碳萃取法或柱色谱法等，目的都是获得以卵磷脂和脑磷脂为主成分的混合物作为原料。本专利技术也可用于人工合成的卵磷脂和脑磷脂为主成分的混合物的分离纯化。本专利技术主要以大豆和蛋黄磷脂(其它磷脂可如法分离纯化)为例，来阐述采用置换色谱技术分离纯化卵磷脂和脑磷脂的方法。原料预处理大豆油脚中富含磷脂，可作为原始原料来提取卵磷脂和脑磷脂。油脚先经脱水，得到浓缩磷脂。再用1-2倍的丙酮浸洗3-6次，脱除油脂后得粉末磷脂。然后用2-4倍量的95wt％乙醇于60℃下浸提粉末磷脂3-5次至浸提液为浅黄色。合并浸提液并真空浓缩，然后加入丙酮使磷脂沉淀。分离沉淀物和溶剂，所得沉淀经真空脱溶、干燥后得到用于置换分离的原料(参见中国财经出版社出版的《油脂工业副产品综合利用》张根旺等编著)。鲜鸡蛋置于冰箱中冷冻过夜，然后将蛋黄与蛋清分离。蛋黄经真空脱水，然后用1-2倍的丙酮洗涤蛋黄2-4次。再用2-4倍量的95wt％乙醇浸提数次，浸提液经真空浓缩，然后加入丙酮使磷脂沉淀。分离出沉淀物，经真空脱溶、干燥后备用。置换色谱分离置换色谱分离设备为高效液相色谱仪。色谱柱长径比为20∶1-60∶1，固定相为3-20um硅胶填料，进样阀(液相色谱用六通阀)带0.5-2mL进样环，流动相为二氯甲烷-甲醇，置换剂为乙醇胺，再生剂为二氯甲烷-甲醇-乙酸。色谱系统先用流动相平衡。待系统平衡后，打开排液阀并加大流量，改用置换剂将排液阀前的管路和泵内的流动相溶剂置换为置换剂溶液。关闭泵和排液阀，将进样阀旋至“Load”处。称取固定相填料重量的1-15％的卵磷脂和脑磷脂为主成分的混合物，溶于0.5-2mL流动相溶剂中，用注射器进样至进样阀中。调节流速为0.1-0.5mL/min，进样阀旋至“Injection”处并打开泵。每0.1-1mL收集一次洗出液，经HPLC检测。根据检测结果，分别合并含有脑磷脂和卵磷脂的收集液，经真空浓缩、脱溶、干燥后得高纯脑磷脂和卵磷脂。待置换剂流出色谱柱后，改用再生剂(体积比为50-90∶10-40∶5-15的二氯甲烷、甲醇和乙酸的混合液)在大流速条件下冲洗色谱柱。再生完成后再用流动相平衡，进行新的置换分离。实施例一置换色谱分离所用泵为日本岛津LC-6A，色谱柱为150mm×4.6mm自装硅胶柱(3-5um)，进样环体积为0.5mL，流动相为二氯甲烷-甲醇(95∶5，V/V)，置换剂为溶于流动相溶剂的300mM乙醇胺，流速为0.2mL/min。称取大豆混合磷脂100mg，溶于0.5mL二氯甲烷-甲醇(95∶5，V/V)中进样。每0.2mL收集一次洗出液。所得卵磷脂的纯度和得率分别为90.6％和76.5％，脑磷脂的纯度和得率分别为84.5％和97.1％。实施例二置换色谱分离所用泵为日本岛津LC-6A，色谱柱为150mm×4.6mm自装硅胶柱(5-10um)，进样环体积为0.5mL，流动相为二氯甲烷-甲醇(85∶15，V/V)，置换剂为溶于流动相溶剂的200mM乙本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：达世禄，冯钰锜，张维农，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：