“SARS”病毒特异性转移因子及其制备方法技术

一种制备“ＳＡＲＳ”病毒特异性转移因子的方法，该方法包括如下步骤：　　　　（１）对“ＳＡＲＳ”病毒进行灭活，制得灭活的“ＳＡＲＳ”病毒；　　　　　（２）用灭活的“ＳＡＲＳ”病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内；　　　　（３）从免疫后的动物的组织中提取“ＳＡＲＳ”病毒特异性转移因子；　　　　（４）将提取的“ＳＡＲＳ”病毒特异性转移因子进行精制、纯化和分装。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种“SARS”病毒特异性转移因子及其制备方法，具体地讲，本专利技术涉及一种以灭活的“SARS”病毒为抗原制得的“SARS”病毒特异性转移因子及其制备方法。
技术介绍
SARS病毒是在今年我国乃至世界范围内肆虐的SARS病的元凶。它的传播严重影响了人们的正常生活秩序。SARS病毒是一种崭新的冠状病毒，非某种已知冠状病毒的近期变种。冠状病毒是一种RNA病毒。2003年3月以来，国内外相继报道了引起SARS冠状病毒的基因序列，该病毒含有完整的5’末端序列、编码序列和3’末端序列，全RNA基因组长度为29727核苷酸，基因编码区的组成结构与其他冠状病毒类似，包括多个开放阅读框架(ORFs)，分别编码病毒的多聚合酶蛋白(polymerase 1a，1b)和结构蛋白。转移因子(Transfer factor)是白细胞中有免疫活性的淋巴细胞所释放的一种低分子核苷酸和多肽，其本质是少量核酸和小分子多肽的混合物。它可以将被某种抗原(病原)免疫的特异性免疫反应从某一个体转移到另一个体，非特异性地提高受者的免疫功能，促进免疫细胞因子释放。转移因子具有可透析性，不含蛋白，粗制转移因子中含多肽、核酸，其活性不为胰蛋白酶、DNA酶和RNA酶所破坏，在-20℃条件下可长期保存，分子量小于5000。转移因子还具有转移细胞免疫的能力。在使用很小的剂量就能使受体产生局部或全身反应，作用时间快，3-4h就可激活宿主的淋巴细胞，使受体致敏，持续时间可长达一年之久。在体外转移因子可使未致敏的淋巴细胞致敏，胸腺嘧啶渗入增加，使丧失与绵羊红细胞形成玫瑰花能力的淋巴细胞部分地恢复。转移因子不能在种间交叉转移，现已证明，动物种间、成人与动物之间均可相互转移，仅仅是转移程度有差异。转移因子在国内生产和临床应用多年，包括非特异性转移因子和特异性转移因子。非特异性转移因子主要用于提高人体的免疫功能和抗病能力，而特异性转移因子除了具备非特异性转移因子的功能外，还可以激发针对某种抗原的免疫反应。转移因子一般从脾脏和淋巴结等免疫器官和白细胞中提取。我国专利申请03108006.5公开了一种抗非典病毒转移因子制备方法，首先，非典病毒经Hep-2细胞、人胚肾细胞、人胚肺细胞或鸡胚培养增殖，制备非典病毒抗原以及根据非典病毒的基因序列用基因工程方法表达制备的保护性抗原。其次，以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原或以20％蔗糖沉层浓缩抗原。然后，用所提取的病毒抗原免疫动物。最后，从免疫动物中提取抗非典病毒转移因子。至今，人们仍未研制出一种能有效地治疗SARS的药物。明年SARS病毒有可能会卷土重来，威胁人类的健康。研究对有效治疗和预防SARS的药物的任务迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种制备“SARS”病毒特异性转移因子的方法。在本专利技术的制备“SARS”病毒特异性免疫核糖核酸的方法中包括如下步骤(1)对“SARS”病毒进行灭活，制得灭活的“SARS”病毒；(2)用灭活的“SARS”病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内；(3)从免疫后的动物的组织中提取“SARS”病毒特异性转移因子；(4)将提取的“SARS”病毒特异性转移因子进行精制、纯化和分装。上述的制备方法基于下面的原理灭活的“SARS”病毒中的抗原成分可以诱导和刺激动物产生免疫反应，激活体内免疫活性细胞等，而这些细胞会分泌转移因子，从而激活针对“SARS”病毒的特异性细胞免疫反应。本专利技术的专利技术人根据这一原理，利用在广州分离获得的“SARS”病毒，经灭活后制成灭活疫苗，然后与可以加强免疫刺激效应的佐剂一起注射到猪等动物体内，诱发动物产生特异性的免疫反应。证实产生免疫反应后，提取肝、脾、淋巴结等组织中的转移因子，从特异性免疫的角度生产出一种抗“SARS”的有效治疗药物。在步骤(1)之前，可以通过PCR扩增SARS病毒。步骤(1)中灭活可以是甲醛灭活或者是温度灭活，也可以采用其他的灭活方法。流感病毒采用市售的灭活病毒，而“SARS”病毒要经过灭活。灭活条件的控制的关键在于对灭活温度、时间或甲醛浓度的控制。采用温度灭活时温度控制在46-66℃范围，时间控制在10-100分钟内。例如可以采用56℃60分钟。甲醛浓度在0.10％-1.00％。灭活的时间为数小时至数十小时。例如，可以用0.2％的甲醛灭活SARS病毒24小时以上，或者0.4％的甲醛灭活SARS病毒2小时以上，可以使SARS病毒丧失感性，灭活率为100％；病毒灭活前后抗原不受影响。尽管0.2％的甲醛作用24小时以上可以灭活病毒，但能检测出高拷贝的核酸，因此优选采用0.4％的甲醛灭活24小时作为灭活SARS疫苗的条件。这种灭活方法能有效地灭活病毒，并且灭活前后抗原不受影响。在步骤(2)中除了灭活的“SARS”病毒和免疫佐剂之外，还采用流感病毒的灭活疫苗一起进行混合后，来联合免疫动物。其中，佐剂可以增强免疫效果，使用的佐剂可以是佛氏佐剂包括佛氏完全佐剂(FCA)和佛氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂、CpG佐剂中的一种或几种，优选为使用佛氏佐剂完全佐剂或不完全佐剂。更优选为使用佛氏佐剂完全佐剂和不完全佐剂。免疫的动物可以是小鼠、大鼠、兔、猪、牛、猴或马，优选为猪。免疫的方法可以是单独用SARS灭活疫苗免疫动物，也可以是用SARS灭活疫苗与流感疫苗同时对动物进行免疫。由于用“SARS”和流感病毒抗原联合免疫动物，制造出来的转移因子对“SARS”和流感都具有特异性，是本专利技术的关键所在，因此优选采用此方案。免疫(接种)可以是单次注射，也可以是多次注射。由于一般要多次注射才能达到高免疫状态，所以优选为多次注射。接种方法优选为背部多点肌肉注射。选择合适的免疫的时间间隔和长度可以达到较好的免疫效果。一般需要数天的时间。优选为0天、15天、21天、40天进行接种。在步骤(3)中采集免疫后动物的肝、脾和/或淋巴结组织，将其细胞破碎，然后提取“SARS”病毒特异性转移因子。其中，细胞破碎的方法可以采用组织捣碎机捣碎、超声波破碎等，但是常用组织捣碎机捣碎，制成匀浆。提取“SARS”病毒特异性转移因子的方法为冻融透析法、孵育透析法或乙醇提取法。在步骤(4)中可以按照现有技术采用微孔滤膜过滤、超滤、透析等方法进行精制和纯化。在步骤(4)之后可以根据需要进行鉴定、活性检测，例如用核酸测定法检测浓度，用生物活性法测定特异性和作用。精制和纯化后得到的“SARS”病毒特异性转移因子可以在无菌条件下进行分装。另一方面，本专利技术还提供了一种由方法制备的“SARS”病毒特异性转移因子，既可以是以灭活的“SARS”病毒为抗原制得的，也可以是以灭活的“SARS”病毒和流感病毒灭活疫苗为抗原制得的。对“SARS”病毒和流感病毒都有特异性，从而能够对“SARS”和流感均起到有效的治疗效果。经严格的检测，由这种方法制得的“SARS”病毒特异性转移因子符合国家生物制品标准，该特异性免疫的转移因子对提升人体抗“SARS”病毒感染的能力具有明显效果，对“SARS”和流感治疗都有特异治疗作用，对人体无毒副作用的优点，填补了“SARS”治疗无有效和特异药物的国内外空白，对防治“SARS”有特殊意义。以下结合实施例，来进一步说明本专利技术，但本专利技术并不局限于这些实施例，任何依照本专利技术的基本精神的改进或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆家海，王一飞，潘兴华，
申请(专利权)人：陆家海，
类型：发明
国别省市：