抗“SARS”病毒高免血清及其制备方法技术

一种制备抗“ＳＡＲＳ”病毒高免血清的方法，所述的方法包括以下步骤：　　　　（１）用甲醛灭活的方法或温度灭活的方法对“ＳＡＲＳ”病毒进行灭活，制得灭活的“ＳＡＲＳ”病毒；　　　　（２）用灭活的“ＳＡＲＳ”病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内；　　　　（３）采集免疫后动物的血液；　　　　（４）从步骤（３）所采集的血液中分离出血清。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗“SARS”病毒高免血清及其制备方法，更具体地讲，本专利技术涉及一种以灭活的“SARS”病毒为抗原制得的抗“SARS”病毒高免血清及其制备方法。
技术介绍
SARS病毒是在去年我国乃至世界范围内肆虐的SARS病的元凶。它的传播严重影响了人们的正常生活秩序。“SARS”病毒是一种崭新的冠状病毒，非某种已知冠状病毒的近期变种。冠状病毒是一种RNA病毒。2003年3月以来，国内外相继报道了引起SARS冠状病毒的基因序列，该病毒含有完整的5’末端序列、编码序列和3’末端序列，全RNA基因组长度为29727核苷酸，基因编码区的组成结构与其他冠状病毒类似，包括多个开放阅读框架(ORFS)，分别编码病毒的多聚合酶蛋白(polymerase 1a，1b)和结构蛋白。球蛋白制剂是最常见的免疫血清，球蛋白制剂有破伤风抗毒素、白喉抗毒素、气性坏疽毒素、肉毒抗毒素、抗炭疽血清等。目前，市场上常见的球蛋白制剂有抗狂犬病血清、抗蛇毒血清。抗狂犬病血清由狂犬病毒免疫马，经胃蛋白酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂。用于配合抗狂犬病疫苗对被疯动物严重咬伤如头、脸、颈部或多部位咬伤者进行预防注射，被疯动物咬伤后注射愈早愈好，咬后48小时之内注射，可减少发病率。抗蛇毒血清用蛇毒免疫马后的马血浆精制而成，供治疗蛇咬伤者之用。我国的专利申请03128064.1公开了一种用于治疗和预防严重急性呼吸道综合症(SARS)的马抗严重急性呼吸道综合症血清，它是由组织培养SARS灭活病毒免疫马匹获得免疫血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂，具有特异性中和SARS病毒的作用，用于受SARS病毒感染病人的治疗，还可用于高危人群的预防。通常采用静脉注射，也可做肌内或皮下注射。我国的专利申请03128116.8公开了一种用于预防和治疗SARS的免疫制剂，它是由SARS病人恢复期血浆或者含高效价SARS病毒抗体的健康人血浆经低温乙醇蛋白分离法提取并经病毒灭活处理制备的人SARS免疫球蛋白，能有效地治疗受SARS病毒感染的病人，还可用于高危人群的预防。至今，人们仍未有一种能有效地治疗SARS的药物。明年SARS病毒有可能会卷土重来，威胁人类的健康。因此，研究有效治疗和预防SARS的药物的任务迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供了一种制备治疗SARS病毒(SARSV)的高免血清的方法。本专利技术制备抗“SARS”病毒高免血清的方法包括以下步骤(1)用甲醛灭活的方法或温度灭活的方法对“SARS”病毒进行灭活，制得灭活的“SARS”病毒；(2)用灭活的“SARS”病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内； (3)采集免疫后动物的血液；(4)从步骤(3)所采集的血液中分离出血清。该方法还可以进一步包括如下步骤(5)从步骤(4)所得到的血清中进一步分离出有效成分；(6)对步骤(5)所得到的有效成分进行精制和纯化。上述制备方法是基于下面的原理灭活的“SARS”病毒中的抗原成分可以诱导和刺激动物产生高滴度中和抗体，而这种中和抗体又可以在人体内与“SARS”病毒特异性结合，清除进入体内的“SARS”病毒而达到治疗“SARS”的目的。本专利技术的专利技术人根据这一原理，利用在广州分离获得的“SARS”病毒，经灭活后制成灭活疫苗，然后与可以加强免疫刺激效应的佐剂一起注射到马、猪等动物体内。证实产生高免抗体后，从血液中提取血清成分。本项目的创新点在于用新发现的“SARS”病毒制备治疗型高免抗体。在上述制备方法的步骤(1)之前，还可以包括对“SARS”病毒进行扩增的步骤。在步骤(1)中，采用的灭活方法可以是甲醛灭活方法，或者是温度灭活方法。灭活之后要进行检测，以确保灭活的“SARS”病毒无致病能力。灭活条件的控制关键在于控制灭活温度、时间以及甲醛浓度。如果选用甲醛进行灭活，则甲醛的浓度可以控制在0.10％-1.00％的范围内，优选为0.15％-0.60％的甲醛，灭活的时间为数小时至数十小时。例如，采用0.2％的甲醛灭活SARS病毒24小时以上，或者0.4％的甲醛灭活SARS病毒2小时以上，都可以使SARS病毒丧失感染性，灭活率为100％，而病毒灭活前后抗原性不受影响。尽管0.2％的甲醛作用24小时以上可以灭活病毒，但能检测出高拷贝的核酸，因此更优选采用0.4％的甲醛灭活24小时作为灭活SARS疫苗的条件。这种灭活方法能有效地灭活病毒，并且灭活前后抗原性不受影响。如果选用温度灭活，则灭活温度一般控制在46-66℃范围内，灭活时间一般控制在10-100分钟范围内。温度灭活可以在水浴中进行。在步骤(2)中用灭活的“SARS”病毒免疫动物时，为加强免疫效果和获得高含量抗体，优选将免疫佐剂和灭活的“SARS”病毒混合后肌肉注射到动物体内。其中，免疫的动物可以是小鼠、大鼠、兔、猪、牛、猴或马，优选为马或猪。免疫的方法既可以是单独用灭活的“SARS”病毒(“SARS”灭活疫苗)免疫动物，也可以采用“SARS”灭活疫苗与流感疫苗联合对动物进行免疫。为了特异性地提高人体对“SARS”病毒和流感病毒的免疫功能，优选采用“SARS”灭活疫苗与流感疫苗联合对动物进行免疫，更优选将免疫佐剂和“SARS”灭活疫苗与流感疫苗混合后肌注到动物体内。本专利技术所使用的免疫佐剂可以是如下物质中的一种或几种佛氏佐剂(Freund’s adjuvant，包括佛氏完全佐剂(FCA)和佛氏不完全佐剂(FIA))、氢氧化铝和CpG，优选为佛氏完全佐剂或佛氏不完全佐剂，更优选为佛氏完全佐剂和佛氏不完全佐剂。免疫程序分基础免疫和加强免疫。基础免疫一般注射两次抗原，第一次用FCA+SARSV，第二次及其以后用FCA+SARSV。加强免疫在基础免疫的数天后进行接种方法可以是背部多点皮下注射、背部多点肌肉注射、臀部肌肉注射。选择合适的免疫的时间间隔和长度可以达到较好的免疫效果。在步骤(4)中，所采用的分离血清的方法为常温自然凝聚法或铅块压出法。可以考虑进行步骤(5)和(6)的原因是动物的血清直接注射给人可能会引起副反应。因此可以对血清进行纯化和提取有效成份分离出血清中的免疫球蛋白G(IgG)。IgG的分离、精制和纯化的方法是用层析柱IgG。用酶切的办法将有效成份IgG消化成片段，再用凝胶层析法提取有效片段，去掉无效成份。酶优选为木瓜蛋白酶。然后进行柱亲和纯化。在步骤完成(4)或完成(5)和(6)之后可以进行鉴定、活性检测，例如用蛋白测定法检测浓度，用中和抗体试验检测血清、IgG以及Fab片段，得到中和“SARS”病毒的效价。还可以对产品在无菌条件下分装。本专利技术采用的是动物血清成份。虽然动物血清成份用于人体不如人缘血清，但目前的国内外技术均还不能把动物血清人源化，而且靠收集“SARS”患者的血清无法大量地制备抗“SARS”病毒高免血清。因此本专利技术是适合工业化生产的技术。用这种方法制得的高免血清对提升人体抗“SARS”病毒感染的能力具有明显效果，对其他病毒或微生物无交叉反应，对人体无毒副作用的优点，填补了“SARS”治疗无有效和特异药物的国内外空白。以下结合实施例，来进一步说明本专利技术，但本专利技术并不局限于这些实施例，任何依照本专利技术的基本精神的改进或替代，仍属于本专利技术权利要求书中所要求保护的范本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆家海，王一飞，潘兴华，
申请(专利权)人：陆家海，
类型：发明
国别省市：