SARS病毒特异性免疫核糖核酸及其制备方法技术

一种制备ＳＡＲＳ病毒特异性免疫核糖核酸的方法，该方法包括如下步骤：　　　　（１）对ＳＡＲＳ病毒进行灭活，制得灭活的ＳＡＲＳ病毒；　　　　（２）用灭活的ＳＡＲＳ病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内；　　　　（３）从免疫后的动物的组织中提取ＳＡＲＳ病毒特异性免疫核糖核酸；　　　　（４）将提取的ＳＡＲＳ病毒特异性免疫核糖核酸进行精制、纯化和分装。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种SARS病毒特异性免疫核糖核酸及其制备方法，更具体地讲，本专利技术涉及一种以灭活的SARS病毒为抗原制得的SARS病毒特异性免疫核糖核酸及其制备方法。
技术介绍
SARS病毒是在去年我国乃至世界范围内肆虐的SARS病的元凶。它的传播严重影响了人们的正常生活秩序。SARS病毒是一种崭新的冠状病毒，非某种已知冠状病毒的近期变种。冠状病毒是一种RNA病毒。2003年3月以来，国内外相继报道了引起SARS冠状病毒的基因序列，该病毒含有完整的5’末端序列、编码序列和3’末端序列，全RNA基因组长度为29727核苷酸，基因编码区的组成结构与其他冠状病毒类似，包括多个开放阅读框架(ORFS)，分别编码病毒的多聚合酶蛋白(polymerase 1a，1b)和结构蛋白。特异性免疫核糖核酸(immune RNA，iRNA)从被某种抗原致敏的动物脾脏和淋巴结提取的含有大量核酸的物质，能将抗原刺激的动物对抗原的免疫反应性传递给正常动物。iRNA制品实际上是一种总RNA，其中的免疫活性成分只占极小部分。RNA早期研究工作所用的原材料都是脾脏和淋巴结，但后来一些人的研究证明来自肝脏的RNA亦有传递特异免疫功能的作用，并认为肝脏中有许多细胞如枯否细胞等在免疫中具有一定作用。国内研究人员不仅用大量实验证明iRNA能传递抗肿瘤和抗HbsAg的免疫反应性，并进行了大量的临床试用研究；而且已有研究人员对治疗动物的传染病尤其是犬类的病毒性疾病(如犬细小病毒和犬瘟热病毒)、羔羊的B型魏氏梭菌感染等进行了研究。结果证明iRNA对这些疾病的治疗起到了积极的作用，取得了明显的疗效。目前，特异性免疫核糖核酸主要从经特异性抗原免疫的动物肝、脾、淋巴节等组织中提取。关于特异性免疫核糖核酸的提取技术工艺和鉴定标准国内已经标准化，有固定的步骤和方法可以遵循。特异性免疫核糖核酸的提取技术工艺已用于制备抗肿瘤、抗乙肝等药物。但是由于使用的抗原不同，免疫动物的基本方法因抗原不同就各有不同，并且从而获得的产品虽然物理、化学特性相似，但用途和功能完全不同。我国专利申请03125171.4公开了一组抑制SARS病毒感染的小的单链或双链RNA分子及其作用靶标以及该RNA分子在抑制SARS病毒及与SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染中的应用。至今，人们仍未有一种能有效地治疗SARS的药物。明年SARS病毒有可能会卷土重来，威胁人类的健康。因此，研究有效治疗和预防SARS的药物的任务迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种治疗SARS病毒的特异性免疫核糖核酸的制备方法。在本专利技术的制备SARS病毒特异性免疫核糖核酸的方法中包括如下步骤(1)对SARS病毒进行灭活，制得灭活的SARS病毒；(2)用灭活的SARS病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内；(3)从免疫后的动物的组织中提取SARS病毒特异性免疫核糖核酸；(4)将提取的SARS病毒特异性免疫核糖核酸进行精制、纯化和分装。上述制备方法是基于下面的原理灭活的SARS和流感病毒中的抗原成分可以诱导和刺激动物产生免疫反应，激活体内免疫活性细胞等，使这些细胞产生特异性的基因转录物——免疫核糖核酸，这种免疫核糖核酸对SARS和流感有特异性治疗作用。同时，免疫核糖核酸也可以刺激人体免疫功能，非特异性地提高人体的抗病能力的。本专利技术的专利技术人根据这一原理，利用在广州分离获得的SARS病毒，经灭活后制成灭活疫苗，然后与可以加强免疫刺激效应的佐剂一起注射到猪等动物体内，诱发动物产生特异性的免疫反应，在证实其产生免疫反应后，提取肝、脾、淋巴节等组织中的免疫核糖核酸，得到了这种治疗SARS和流感的有效药物。在上述制备方法的步骤(1)之前，还可以包括对SARS病毒进行扩增的步骤。在步骤(1)中，采用的灭活方法可以是甲醛灭活方法，或者是温度灭活方法。灭活之后要进行检测，以确保灭活的SARS病毒无致病能力。灭活条件的控制关键在于控制灭活温度、时间以及甲醛浓度。如果选用甲醛进行灭活，则甲醛的浓度可以控制在0.10％-1.00％的范围内，优选为0.15％-0.60％的甲醛，灭活的时间为数小时至数十小时。例如，采用0.2％的甲醛灭活SARS病毒24小时以上，或者0.4％的甲醛灭活SARS病毒2小时以上，都可以使SARS病毒丧失感染性，灭活率为100％，而病毒灭活前后抗原性不受影响。尽管0.2％的甲醛作用24小时以上可以灭活病毒，但能检测出高拷贝的核酸，因此更优选采用0.4％的甲醛灭活24小时作为灭活SARS疫苗的条件。这种灭活方法能有效地灭活病毒，并且灭活前后抗原性不受影响。如果选用温度灭活，则灭活温度一般控制在46-66℃范围内，灭活时间一般控制在10-100分钟范围内。温度灭活可以在水浴中进行。在步骤(2)中用灭活的SARS病毒免疫动物时，为加强免疫效果和获得高含量抗体，优选将免疫佐剂和灭活的SARS病毒混合后肌肉注射到动物体内。其中，免疫的动物可以是小鼠、大鼠、兔、猪、牛、猴或马，优选为猪。免疫的方法既可以是单独用灭活的SARS病毒(SARS灭活疫苗)免疫动物，也可以采用SARS灭活疫苗与流感疫苗联合对动物进行免疫。为了特异性地提高人体对SARS病毒和流感病毒的免疫功能，优选采用SARS灭活疫苗与流感疫苗联合对动物进行免疫，更优选将免疫佐剂和SARS灭活疫苗与流感疫苗混合后肌注到动物体内。本专利技术所使用的免疫佐剂可以是如下物质中的一种或几种佛氏佐剂(Freund’s adjuvant，包括佛氏完全佐剂(FCA)和佛氏不完全佐剂(FIA))、氢氧化铝和CpG，优选为佛氏完全佐剂或佛氏不完全佐剂，更优选为佛氏完全佐剂和佛氏不完全佐剂。免疫动物(接种)时可以是单次注射，也可以是多次注射。由于一般要多次注射才能达到高免疫状态，所以优选为多次注射。接种方法优选为背部多点肌肉注射。选择合适的免疫的时间间隔和长度可以达到较好的免疫效果。一般需要数天的时间。优选为0天、15天、21天、40天进行接种。在本专利技术的步骤(3)中，可以采集动物的肝、脾、淋巴节等组织，按现有技术的方法破碎细胞，使其有效成分释放出来，然后提取分离出特异性免疫核糖核酸。细胞破碎的方法可以采用组织捣碎机捣碎、超声波破碎等，但是常用组织捣碎机捣碎，制成匀浆。提取SARS病毒特异性免疫核糖核酸的方法可以为溶剂溶解提取法。溶剂溶解的提取方法常用碱性缓冲液——冷酚法，该方法的原理是先将核糖核酸溶解，然后进行沉淀，最后洗涤、离心。该碱性缓冲液可以是Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选为Tris/HCl缓冲液。所用的酚可采用酚的饱和溶液，这样可达到充分溶解核糖核酸的效果。在步骤(4)中，将提取的SARS病毒特异性免疫核糖核酸进行精制、纯化和分装时，可以采用现有技术中微孔滤膜过滤、超滤、透析等方法进行精制和纯化，然后在无菌条件下进行分装。实际上，在分装之前，可以利用核酸测定法检测浓度，利用生物活性法测定其特异性和作用。另一方面，本专利技术还提供了一种按照上述方法所制备的SARS病毒特异性免疫核糖核酸，这种SARS病毒特异性免疫核糖核酸既可以是以灭活的SARS病毒为抗原制得的，对SARS病毒有特异性，从而能够有效地治疗SARS，也可以是以灭活的SARS病毒和灭活的流感病毒为抗原制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆家海，王一飞，潘兴华，
申请(专利权)人：陆家海，
类型：发明
国别省市：