本发明专利技术提供一种抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的制备方法，其包括用于生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的生物反应器的制备方法，即构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；将构建的载体导入乳牛受体细胞，所述受体细胞为受精卵细胞、胚胎干细胞或早期胚胎；利用制得的乳牛受体细胞通过假孕乳牛发育并获得转基因乳牛。从制得的转基因乳牛分泌的牛乳中获得抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸。本发明专利技术的生物反应器可以大量、稳定和高效地制备抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸，实验表明本发明专利技术制备的抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸可以在HCV感染者体内招募沉默复合体，特异性切割HCV基因组，从而杀灭病毒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种用于生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的生物反应器的制备方法以及利用该生物反应器制备抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的方法，通过建立能够特异性表达针对丙型肝炎病毒基因组的干扰核糖核酸(SiRNA)的乳腺生物反应器，为治疗丙肝的SiRNA药物的研制和生产奠定基础。
技术介绍
丙型肝炎病毒Ofepatitis Cvirus)简称丙肝病毒(HCV)，于1978年被发现，其由外壳和其中的单链RNA组成。1989年，HCV基因组序列被首次获得。HCV主要经血源传播，此外还可以通过其他方式传播，如母婴垂直传播和性传播等。HCV感染可引发丙型肝炎，但发病机理仍不十分清楚。临床观察资料表明，人感染HCV后所产生的保护性免疫力很差，临床上50 %的丙型肝炎病人可发展为慢性肝炎，甚至部分病人会发展为肝硬化及肝细胞癌。目前尚无针对丙型肝炎的疫苗，唯一的预防措施是防止血液接触。被发现感染HCV后，通常采取的是聚乙二醇干扰素a-2a或a-2b (peginterferon)联合病毒唑(ribavirin)治疗。这也是迄今为止唯一有效的方案。但是，聚乙二醇干扰素与病毒唑单独和/或联合使用治疗丙型肝炎带来的毒副作用不容忽视，其在适宜人群和与其他药物联用方面也面临诸多限制。近年来出现了多种辅助抗病毒药物治疗的新型技术，包括核酶技术、细胞内干扰性多肽或蛋白质疗法，以及DNA免疫疗法等。其中，核酶(ribozyme)技术是指通过人工合成具有催化活性的小分子核酶，即有催化活性的单链RNA分子，例如发夹状核酶，与靶RNA中的互补序列特异性结合进而进行切割。在上述新型技术中，小干扰核糖核酸(smallinterfering RNA,缩写为siRNA)药物又是一大热点。RNA干扰(RNA interference,缩写为RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导人与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解，从而导致基因表达沉默。此现象可对外来基因材料，如转位子、病毒等对基因组的破坏起到防御作用。通过RNAi机制，siRNA可特异性地、有效地沉默靶基因。已有研究证明，siRNA作用于HCV、HBV和HIV，都能表现出抗病毒作用(Nat.B1technol.21(6):639-644(2003) ；S.B.Kapadia, et al.1nterference of hepatitis C virus RNArepli cat1n by short interfering RNAs.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.100 (4):2014-2018(2003) ；J.A.Wilson, et al.RNA interference blocks gene express1n andRNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.100(5):2783-2788(2003) ；A.P.McCaffrey, et al.1nhibit1n ofhepatitis B virus in mice by RNA interference.G.A.Coburn and B.R.Cullen.Potentand specific inhibit1n of human immunodeficiency virus typelreplicat1n by RNAinterference.J.Virol.76(18):9225-9231 (2002))。虽然使用siRNA治疗丙肝的疗效前景乐观，但仍需克服诸多方面的技术难题，包括siRNA的靶向性有效释放、siRNA的制备等。目前，制备siRNA的方法主要有化学合成法、体外转录法、酶切长链dsRNA法、siRNA表达载体法和PCR表达框法。这些方法普遍存在产出率较低、生产成本较高的缺点。动物乳腺生物反应器的研究则始于1987年，Gordon等将组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了 37只在乳汁中能表达tPA的转基因小鼠。同年，世界上第一只能从乳汁中分泌α 1-抗胰蛋白酶(AAT)的转基因绵羊在英国罗斯林研究所诞生。从此，开始了乳腺生物反应器的实用性研究。Simons等(Simons等，1987年)将带MT启动子的β -乳球蛋白_凝血因子IX(BLG-FIX)、BLG-AAT等重组DNA片段注射到绵羊受精卵中，获得了在乳汁中有外源基因表达的转基因后代。Wilmut等将羊乳球蛋白基因片段与F-1X和AAT-cDNA融合质粒注入小鼠及绵羊受精卵中，获得乳汁中含F-1X和AAT的转基因小鼠及绵羊。Wright等将绵羊BLG基因调控区与人AAT基因相连，获得了 4只转基因绵羊。Velander等利用WAP基因启动子与人蛋白质C(hPC) cDNA重组基因获得转基因猪，重组hPC的表达量(lg/L)此人血中hPC浓度还高200倍。Ebert等用β-CA基因的启动子引导tPA在山羊乳汁中得到表达(l_3g/L)。Wilmut等(Wilmut等，1997年)首创体细胞克隆rl并表达人F-1X的转基因克隆绵羊。2000年，英国PPL公司将人类AAT基因定点整合到胎儿成纤维细胞的前胶原基因座上，用转基因细胞生产转基因打靶绵羊(McCreath等，2000年)；2001年，他们又利用基因打靶技术生产出了AAT、3-GT和朊病毒双剔除的克隆绵羊。上述研究可以看出，从模式动物-小鼠的转基因研究开始，研究人员逐步建立起了大动物乳腺生物反应器制备的技术平台。
技术实现思路
目前，治疗HCV感染采用的干扰素和核苷类似物普遍存在副作用较大，疗效不理想，且几乎不可避免出现病毒耐药变异性等缺陷，而自上世纪90年代兴起的RNAi技术以其对病毒抑制作用的靶向性、特异性和高效性，为HCV感染的治疗带来新的希望。但是，现有RNAi技术所必需的siRNA的制备技术尚存在产出率低和生产成本高等缺陷，而动物乳腺生物发生器技术以其天然、高效和低成本的特征，可以克服上述siRNA制备技术的缺陷。本专利技术人将目光锁定在牛乳腺生物发生器在生产抗HCV siRNA方面的应用前景，通过转基因技术形成可在牛乳中表达抗HCV siRNA的乳牛，使其稳定而高效地生产抗HCV的siRNA，为HCV的基因药物研发提供稳定的物质基础。具体来说，将外源目的基因导入乳牛基因组并定位表达于牛乳腺中，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌有机物的能力，从牛乳中生产出具备抗HCV能力的si RNAs。本专利技术所述的生物反应器是指采用转基因方法将外源性目的基因转入生物，例如乳牛，形成的能够分泌外源性目的基因产物的生物体，例如乳牛。本专利技术提供一种用于生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的生物反应器的制备方法，该制备方法包括以下步骤:(I)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；具体来说，所述抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸为能够导致丙本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于生产抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的生物反应器的制备方法，该制备方法包括以下步骤：(1)构建包含编码抗丙型肝炎病毒小干扰核糖核酸的基因序列的载体；(2)将步骤(1)构建的载体导入乳牛受体细胞，所述受体细胞为受精卵细胞、胚胎干细胞或早期胚胎；(3)利用步骤(2)制得的乳牛受体细胞通过假孕乳牛发育并获得转基因乳牛。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张辰宇，
申请(专利权)人：江苏命码生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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