一种基于小RNA干扰原理的新型核酸制造技术

一种基于RNA干扰原理的交替核酸双链，其序列的碱基由腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶U、和胞嘧啶C组成，各碱基通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖交替连接而成。该双链可以形成完全配对或大部分配对，各链的长度为18-30碱基。第一链的碱基最佳顺序是5`-GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`，第二链的最佳碱基顺序是5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`，能干扰核苷酸还原酶而起到抗肿瘤效应，其中碱基U和T可以替换。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于RNA干扰原理的新型核酸：交替核酸双链。其序列的碱基由腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶U、和胞嘧啶C组成，各碱基通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖交替连接而成。 
技术介绍
小RNA干扰是生物学中常见现象，通过干扰可以在翻译水平降低某些蛋白质的表达水平从而影响生物功能。生物可以通过多种方式产生约21碱基对（bp）的双链小RNA，小RNA通过碱基配对识别特异RNA，然后通过特异机制将识别的RNA进行降解破坏，最终阻止或减少功能蛋白的翻译。 如果以外源方式模拟体内形成的小RNA，也能有目的地破坏细胞内的特异RNA序列从而减少甚至终止其蛋白质翻译，最终实现编码该蛋白基因的功能下调或缺失（沉默），从而可以治疗因某些基因表达上调所致的疾病。 目前实现RNA干扰的策略有两种，一种是构建一种特殊载体（质粒或病毒），感染宿主细胞后能转录出特异的RNA双链，通过该双链RNA实现RNA干扰，从而沉默某个基因功能。另一种方式是通过化学合成方法直接合成特异的双链RNA，通过阳离子脂质体、纳米粒等方式将该双链RNA转化到宿主细胞从而沉默基因功能。 以上第一种方式已广泛用于实验研究，其优点是效率高且经济，转染一次可以实现长效沉默。但该方法很难应用于临床，因为该方法的安全性很难通过。由于转染的是具有微生物性质的载体（病毒和质粒均能在宿主细胞内复制），其所携带的核酸有可能长期存在宿主细胞内甚至整合到基因组。外源核酸长期存在细胞内甚至整合到染色体所带来的长期安全性短时间内很难评估，也不可控。因此，第一种方法一直不能用于临床的原因主要是安全性问题。 以上提及的第二种方法在实验研究中也有所应用，但成本较高。主要原因是RNA不稳定，很难合成，且在存放、应用过程中容易发生降解而失效；即使进入体内，但在进入细胞之前也容易被体内的RNA酶降解。为了保证疗效，可能要使用更高剂量的双链RNA。与第一种方法相比，该方法的生物安全性较低，但成本较高，现在也已经用于临床研究。像国外的Calando Pharmaceuticals, Inc.公司已经合成针对核苷酸还原酶RRM2亚基的RNA干扰序列，已完成临床前研究并进入临床研究。其优化序列是5`-GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`和5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`。核苷酸还原酶是合成脱氧核糖核苷酸的关键酶，肿瘤细胞常处于高表达状态，此酶的表达沉默后，导致脱氧核糖核苷酸合成减少甚至无法合成，从而很难合成DNA，导致细胞无法增值，最终产生抗肿瘤作用。 通过外源双链RNA进行RNA干扰实现抗肿瘤的最大优势抗肿瘤的针对性很强。但外源合成双链RNA稳定性较差，成本较高，导致使用该类药物的经济负担很重。本专利技术试图在保持较好干扰作用的基础上，将双链RNA改变成交替核酸双链，以降低其合成成本，并增加其稳定性。 
技术实现思路
专利技术一种交替核酸双链，即每条链的碱基A、T、C、G、U按照一定顺序通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖交替连接，其中T和U可以相互替换，各链的长度为18-30碱基。较佳方式是将四种之一的核糖核苷酸（A、U、C或G）和四种之一的脱氧核糖核苷酸（dA、dT、dC或dG）按照一定的顺序形成两条交替核酸链。这两条链能按照碱基互补原理（A:T/U；C:G）形成完全双链或大部分双链以干扰或沉默相应的基因。对于用于沉默人核苷酸还原酶的交替核酸双链来说，第一链较佳序列是5`-dG-A-dT-U-dT-A-dG-C-dC-A-dA-G-dA-A-dG-U-dT-C-dA-G-dT-3`（d表示脱氧）或5`-G-dA-U-dT-U-dA-G-dC-C-dA-A-dG-A-dA-G-dT-U-dC-A-dG-U-3`；第二链的较佳序列是5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`或5`-U-dG-A-dA-C-dT-U-dC-U-dT-G-dG-C-dT-A-dA-A-dT-C-dG-C-3`。第一链的任意一条和第二链的任意一条可以进行组合形成具有抗肿瘤效应的双链，用于干扰核苷酸还原酶。第一链和第二链的碱基配对示意图参见图1-4。 该专利技术的优势是，该双链既不是DNA也不是RNA，但能够保证碱基配对。由于各碱基通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖逐一交替连接，这种结构既不能被体内的DNA酶降解，也不能被RNA酶降解，因此在体内的稳定性较高。而且这种核算单元未进行化学修饰，是体内能正常形成的，故推断其自然降解后的安全性较高。 附图说明图1-4是第一链和第二链的碱基配对四种方式示意图，两条链碱基之间的圆点表示存在碱基配对。 图5是DNA和RNA双链，DNA和交替核酸双链对人肺癌A549细胞的影响作用：18#表示DNA（5`-GATTTAGCCAAGAAGTTCAGT-3`）和RNA（5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`）双链对A549细胞的影响；19#表示DNA（5`-GATTTAGCCAAGAAGTTCAGT-3`）和交替核酸（5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`，d特指脱氧）双链对A549细胞存活的影响。 图6是RNA双链和交替核酸双链对人肺癌A549细胞的影响作用：38#表示RNA双链（5`-GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`和5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`）对A549细胞存活的影响；59#表示交替核酸双链（5`-dG-A-dT-U-dT-A-dG-C-dC-A-dA-G-dA-A-dG-U-dT-C-dA-G-dT-3`和5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`，d特指脱氧）对A549细胞存活的影响。 图7是正常培养48小时后的A549细胞（放大300倍）。 图8是加入6μg/ml双链RNA（5`-GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`和5`-UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3`）培养48小时后的A549细胞（放大300倍）。 图9是加入6μg/ml交替核酸双链（5`-dG-A-dT-U-dT-A-dG-C-dC-A-dA-G-dA-A-dG-U-dT-C-dA-G-dT-3`和5`-dT-G-dA-A-dC-U-dT-C-dT-U-dG-G-dC-U-dA-A-dA-U-dC-G-dC-3`，d特指脱氧）培养48小时后的A549细胞（放大300倍）。 具体实施方式实施示例1。 将1mg/ml的单链核酸（DNA：5`-GATTTAGCCAAGAAGTTCAGT-3`、RNA: 5`-GAUUUAGCCAAGAAGUUCAGU-3`和交替核酸dG-A-dT-U-dT-A-dG-C-dC-A-dA-G-dA-A-dG-U-dT-C-dA-G-dT，d特指脱氧）置于80℃热处理，冷却到室温后加入Invitrogen公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于RNA干扰原理的交替核酸双链，其序列的碱基由腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶U、和胞嘧啶C组成，各碱基通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖交替连接而成。

【技术特征摘要】
1. 一种基于RNA干扰原理的交替核酸双链，其序列的碱基由腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、尿嘧啶U、和胞嘧啶C组成，各碱基通过磷酸核糖和磷酸脱氧核糖交替连接而成。
2. 根据权利要求1所述的交替核酸双链，其特征是：双链可以形成完全配对或大部分配对，各链的长度为18-30碱基。
3. 根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：段为钢，侯肖霖，
申请(专利权)人：云南中医学院，
类型：发明
国别省市：云南;53