抗病毒细胞及其用途制造技术

本发明专利技术提供了哺乳动物细胞系，所述哺乳动物细胞系已经经过了基因工程改造，从而致使这类细胞系对病毒进入和/或繁殖具有抗性；而且提供了一种使用所述细胞系来减少或防止生物生产系统的病毒污染的方法。

Antiviral cells and uses thereof

The invention provides a mammalian cell line, the mammalian cell lines have been genetically engineered, resulting in this kind of cell line for virus entry and / or breeding resistant; and provides a method for using the cells to reduce or prevent biological production systems contaminated with the virus.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及经工程改造而具有抗病毒性的哺乳动物细胞系和所述细胞系用于减少或防止生物生产系统的病毒污染的用途。背景重组产生的治疗性蛋白质用于治疗许多疾病或病状(诸如癌症和自身免疫性疾病)的用途不断增加。然而，这些蛋白质治疗剂的大规模生产仍然是一个挑战。举例来说，工业制造过程中必须实现可靠高收率，使得下游工艺产生极纯的产物，只允许痕量污染物至优选地无污染物。使用无动物成分的培养基已经显著地降低了外来病毒污染的发生率。另外，诸如超滤、高温短时间处理和/或对散装材料进行UVC照射之类的程序的实施进一步降低了污染的发生率。然而，病毒污染的风险仍然存在。就产品损失、暂时退出市场和昂贵的去污成本而言，污染事件对制造商将是灾难性的。因此，需要对病毒感染具有增加的抗性的哺乳动物细胞系。附图简述图1呈现了如通过Southern印迹分析所测定的MVM病毒感染的时间过程。利用在24、48、72和96小时针对野生型细胞(CHOZNGS-/-)、Slc35A1KO、COSMCKO、COSMCKO克隆F07、COSMCKO克隆G03和COSMCKO克隆H05所检测的MVM病毒DNA的相对量进行作图。克隆H05具有12bp的框内缺失(即，无移码突变)。图2示出了如通过空斑测定所检测的MVM病毒感染的时间过程。作图的是在24、48、72和96小时针对野生型细胞(CHOZN)、Slc.35A1KO、COSMCKO、COSMCKO克隆F07、COSMCKO克隆G03和COSMCKO克隆H05所检测的pfu/mL。图3示出了MMV感染对细胞生长的影响。作图的是野生型(2E3)(A)和COSMCKO克隆F07(B)细胞在MVM病毒不存在(实线)和以MOI1或8存在(断线)的情况下在120小时过程中的活细胞数目(细胞/ml)。图4呈现了MMV感染后的细胞相关病毒的时间过程。作图的是每个细胞的MVM病毒基因组拷贝数(vgc)(基于假定每一个已感染的细胞可以产生2x104vgc)，如在MVM病毒以MOI1(A)或8(B)存在的情况下通过qPCR在120小时的过程中针对野生型(2E3)(实现)和COSMCKO克隆F07(断线)细胞所检测。图5示出了在指示的细胞系中的MMV复制的时间过程。作图的是用MVM病毒以MOI0.3(A)或0.03(B)感染后0和21小时的vgc/样品。图6呈现了所指示的细胞系中的呼肠孤病毒3复制的时间过程。作图的是在感染Reo-3病毒后0和24小时与野生型细胞(2E3)相关的vgc/样品。.图7呈现了在MVM病毒不存在(UN)或存在(IN)的情况下针对细胞生长进行的生长测定。图A呈现了野生型(GS)、Slc35A1KO、COSMCKO克隆F07和COSMCKO克隆G03在10天内的活细胞密度(VCD)。图B呈现了野生型(GS)、来源于COSMCKO克隆F07的IgG产生克隆71H1和71C3在8天内的VCD。图8呈现了在MVM病毒不存在(UN)或存在(IN)的情况下针对细胞生长进行的生长测定。作图的是野生型(GS)、St3Gal4KO克隆7D10、St3Gal4KO克隆1B08和St3Gal4KO克隆1B10在9天内的VCD。概要在本公开的各种方面中，提供了经工程改造以阻碍或防止细胞中的病毒进入和/或病毒繁殖的哺乳动物细胞系。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞系经过基因修饰，使得与未经修饰的亲本细胞系相比，至少一种病毒的进入和/或繁殖被减少或消除。在各种实施方案中，本文中所公开的哺乳动物细胞系包含至少一个经修饰的染色体序列。在其他实施方案中，所述经修饰的染色体序列是失活的，使得所述细胞系不产生或产生降低水平的编码蛋白质产物。在一个实施方案中，所述细胞系包含至少一个编码核心1酶伴侣(COSMC)的失活染色体序列。在另一个实施方案中，编码COSMC的染色体序列的所有拷贝都是失活的且所述细胞系不产生COSMC。在一个替代实施方案中，所述细胞系包含至少一个编码溶质载体家族35(CMP-唾液酸转运体)成员A1(Slc35A1)的失活染色体序列。在另一个实施方案中，编码Slc35A1的染色体序列的所有拷贝都是失活的且所述细胞系不产生Slc35A1。在又另一个实施方案中，所述细胞系包含至少一个编码核心1伸长酶(C1GalT1)的失活染色体序列。在另一个实施方案中，编码C1GalT1的染色体序列的所有拷贝都是失活的且所述细胞系不产生C1GalT1。在另一个实施方案中，所述细胞系包含至少一个编码St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶1(St3Gal1)的失活染色体序列。在另一个实施方案中，编码St3Gal1的染色体序列的所有拷贝都是失活的且所述细胞系不产生St3Gal1。在一个替代实施方案中，所述细胞系包含至少一个编码St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶2(St3Gal2)的失活染色体序列。在另一个实施方案中，编码St3Gal2的染色体序列的所有拷贝都是失活的且所述细胞系不产生St3Gal2。在又另一个实施方案中，所述细胞系包含至少一个编码St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶3(St3Gal3)的失活染色体序列。在另一个实施方案中，编码St3Gal3的染色体序列的所有拷贝都是失活的且所述细胞系不产生St3Gal3。在又另一个实施方案中，所述细胞系包含至少一个编码St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶4(St3Gal4)的失活染色体序列。在另一个实施方案中，编码St3Gal4的染色体序列的所有拷贝都是失活的且所述细胞系不产生St3Gal4。在一个替代实施方案中，所述细胞系包含至少一个编码St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶5(St3Gal5)的失活染色体序列。在另一个实施方案中，编码St3Gal5的染色体序列的所有拷贝都是失活的且所述细胞系不产生St3Gal5。在又另一个实施方案中，所述细胞系包含至少一个编码St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶6(St3Gal6)的失活染色体序列。在另一个实施方案中，编码St3Gal6的染色体序列的所有拷贝都是失活的且所述细胞系不产生St3Gal6。在一个替代实施方案中，所述细胞系包含编码St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和St3Gal6中的任两者的失活染色体序列。在又一个替代实施方案中，所述细胞系包含编码St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和St3Gal6中的任两者的失活染色体序列。在其他实施方案中，包含编码COSMC、Slc35A1、C1GalT1、St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和/或St3Gal6的失活染色体序列的细胞系还包含编码甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶1(Mgat1)、甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶2(Mgat2)、甘露糖基(α-1，4-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(Mgat3)、甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖胺基转移酶4(Mgat4)和/或甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经基因修饰的哺乳动物细胞系，其中与未经修饰的亲本细胞系相比，至少一种病毒的进入和/或繁殖被减少或消除。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.04 US 61/9478601.一种经基因修饰的哺乳动物细胞系，其中与未经修饰的亲本细胞系相比，至少一种病毒的进入和/或繁殖被减少或消除。2.如权利要求1所述的经基因修饰的哺乳动物细胞系，其包含至少一个经修饰的染色体序列。3.如权利要求2所述的经基因修饰的哺乳动物细胞系，其中所述经修饰的染色体序列是编码核心1酶伴侣(COSMC)、溶质载体家族35(CMP-唾液酸转运体)成员A1(Slc35A1)、核心1伸长酶(C1GalT1)、St3β-半乳糖苷α-2，3唾液酸转移酶1(St3Gall)、St3β-半乳糖苷α-2，3唾液酸转移酶2(St3Gal2)、St3β-半乳糖苷α-2，3唾液酸转移酶3(St3Gal3)、St3β-半乳糖苷α-2，3唾液酸转移酶4(St3Gal4)、St3β-半乳糖苷α-2，3唾液酸转移酶5(St3Gal5)、St3β-半乳糖苷α-2，3唾液酸转移酶6(St3Gal6)或其组合的失活染色体序列。4.如权利要求3所述的经基因修饰的哺乳动物细胞系，其还包含至少一个编码甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶1(Mgat1)、甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶2(Mgat2)、甘露糖基(α-1，4-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖胺基转移酶3(Mgat3)、甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖胺基转移酶4(Mgat4)、甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，6-N-乙酰葡糖胺基转移酶5(Mgat5)或其组合的失活染色体序列。5.如权利要求3所述的经基因修饰的哺乳动物细胞系，其中编码St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5、St3Gal6或其组合的染色体序列是失活的，且所述细胞系经过进一步工程改造以过度表达St6β-半乳糖酰胺α-2，6-唾液酸转移酶1(St6Gal1)、St6β-半乳糖酰胺α-2，6-唾液酸转移酶2(St6Gal2)、St6(α-N-乙酰基-神经氨酰基-2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺1(St6GalNac1)、St6(α-N-乙酰基-神经氨酰基-2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺2(St6GalNac2)、St6(α-N-乙酰基-神经氨酰基-2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺3(St6GalNac3)、St6(α-N-乙酰基-神经氨酰基-2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺4(ST6GalNa...

【专利技术属性】
技术研发人员：林楠，J马斯卡伦哈斯，A常，D安尼安斯，H乔治，K凯泽，
申请(专利权)人：西格马—奥尔德里奇有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US