抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法，步骤：（１）用禽流感病毒疫苗、新城疫病毒疫苗、鸡法氏囊病毒疫苗免疫实验猪；（２）密切监测实验猪体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到峰值时，无菌取实验猪脾脏或抗凝血制备淋巴细胞单层；（３）对淋巴细胞单层进行传代培养；（４）当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养，即获得抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽。本发明专利技术的方法制备的产品无需进一步的提纯，可经超声波及冻融简单处理后直接将混合体用在禽类体内，即可起到抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒及抗菌的作用，同时提高禽类的免疫力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法，特别是涉及 一种抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移包子与抗菌肽的生 产方法。
技术介绍
转移因子是从外来抗原致敏的正常动物白细胞中提取出来的一种淋巴因 子，或从经某种抗原刺激后的恢复期动物血细胞中提取出来的一种淋巴因子。 前者称非特异性转移因子，后者则称特异性转移因子。这两种转移因子在体内 外最重要的是可传递细胞免疫功能，作为过继免疫治疗的一种免疫制剂，在免 疫系统中发挥多种重要作用。转移因子目前的制备方法是将动物新鲜或冷冻的脾脏及淋巴结在25°C左右去除脂肪及结缔组织，然后用纯化水洗净；将洗净的组织切成小块，加入适量水，用组织捣碎机破碎细胞，制成匀浆，加适量纯化水，混匀，置-20°C 反复冻融5 8次，融化温度不得超过37'C;将冻融的匀浆离心(离心温度4 °C),去沉淀，留上清液备用；上清液装透析袋，透析24-48小时，半成品过 滤除菌；成品的配置与检验。抗菌肽是经诱导，由动物免疫防御系统产生的可对抗外源性病原体的防御 性肽类活性物质，分子量小、活性强，具有抗细菌、真菌、病毒和原虫作用， 甚至对癌细胞也具有杀伤作用，应用十分广泛。目前的制备方法是以新鲜鸡小 肠为原料，去脂肪、浆膜和内容物，称重后冷冻剪碎，捣碎成浆。匀桨后隔水 煮沸15分钟，按照l: 1的比例加入5%乙酸，并在4'C条件下搅拌过夜，次 日将混合物在4'C温度条件下以8000转/分钟离心30分钟，取上清，保存在 4-C环境中。将沉淀物用等体积5%乙酸混合，再置于4。C搅拌浸提过夜，重复 上述离心过程，取上清，合并两次上清液，调整pH值，.再次离心，弃沉淀， 上清液冷冻干燥品即为抗菌肽。现有技术制备转移因子及抗菌肽的主要缺点是针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中制备的抗菌肽及转移因子针对疾病没有 特异性，治疗效果不稳定等缺点，提供一种生产工艺简单、成本低、产出率高、 效果更好的抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌 肽的制备方法。本专利技术的技术解决方案概述如下一种抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽 的制备方法，由如下步骤组成(1) 用禽流感病毒疫苗、新城疫病毒疫苗、鸡法氏囊病毒疫苗各1-5mL肌肉 注射免疫40-120日龄实验猪，首次免疫后第7-20天，再以上述疫苗各2mL 肌肉注射加强免疫；(2) 密切监测实验猪体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到高峰值时，无 菌采取实验猪脾脏或抗凝血，用脾脏或抗凝血制备淋巴细胞单层；(3) 对淋巴细胞单层进行传代培养；(4) 当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养，即获得抗禽流感 病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽。本专利技术的优点本专利技术先用禽流感病毒、新城疫碍毒、鸡法氏囊病毒免疫动物，再以较少 的免疫后的猪脾脏或抗凝外周血为原料，制成淋巴细胞单层，在体外培养，诱 导淋巴细胞单层生产出大量抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性 转移因子和抗菌肽的混合体，本专利技术的方法制备的抗禽流感病毒、新城疫病毒、 鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽无需进一步的提纯，可经超声波及冻融 简单处理后直接将混合体用在禽类体内，即可起到抗禽流感病毒、新城疫病毒、 鸡法氏囊病毒及抗菌的作用，同时提高禽类的免疫力。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。 实施例1一种抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽 的制备方法，步骤 (1).免疫用禽流感病毒疫苗、新城疫病毒疫苗、鸡法氏囊病毒疫苗各lmL肌肉注射 免疫90日龄实验猪，同步设立空白对照组，首次免疫第15天，再以上述疫苗 各2mL肌肉注射作为加强免疫；(2) 密切监测实验猪体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到高峰值时，无 菌采取实验猪脾脏，用脾脏制备淋巴细胞单层，步骤为A、 处理猪脾脏取新鲜猪脾脏置于无菌玻璃容器中，加入PBS(pH为7. 2)溶液浸泡半小时 (或浸于质量百分浓度为1%的新洁尔灭溶液中)，取出以酒精消毒脾脏表面， 用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用PBS(pH为7.2)液洗涤一次，再将脾 脏剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成lmm3小块，再用PBS(pH 为7. 2)液洗涤3次，以去除血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞；B、 消化及分散组织块将上步清洗过的PBS(pH7.2)液吸掉、将剪碎的组织块移入锥形瓶中，按 组织块体积的5倍量加入0..25%胰蛋白酶液^8为7. 7)，置37'C水浴中消化 30分钟。每隔10分钟摇动一次锥形瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直 到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出锥形瓶，吸去胰蛋白酶 液，再用PBS(pH为7.2)液洗涤3次，用O. 5%水解乳蛋白——Hanks液洗， 用口径稍大的细管吹打数次，用四层纱布滤过；C、 细胞计数采用标有O. lmm字样的血球计数板进行计数，计数方法与白细胞计数相同；D、 细胞悬液的分装和培养按细胞计数结果，将细胞悬液用德DMEM营养液调整至60万/毫升细胞悬 液。将细胞悬液分装入细胞培养瓶和细胞转瓶，分装量为该瓶容量的1 / 5， 盖上盖，做好标识，然后将细胞培养瓶和转瓶分别放在二氧化碳培养箱和转瓶 机上培养；E、 观察置于37'C培养的细胞，需逐日进行观察。若细胞已生长，则要观察细胞 的形态特征并判断其所处的生长阶段(游离期、吸附期、繁殖期、维持期和衰 退期)，直至形成淋巴细胞单层。(3) 对淋巴细胞单层进行传代培养5在作传代细胞培养前，首先将培养瓶置于显微镜下现察，以确定细胞已长 成单层，即可进行细胞的传代培养。(4)当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养。当脾淋巴传代细胞长成单层后，更换维持液同时加入植物血凝素诱导培养。诱导培养24小时后对产品进行检验将细胞培养物经超声破碎后取样检测转移因子和抗菌肽的浓度。转移因子浓度的测定对转移因子的定量多以多肽含量定量用Folin-酚法或分光光度法测定多肽含量，以多肽含量lmg为一个转移因子单位。此工艺生 产的转移因子含量是常规生产的的4 5倍。抗菌肽浓度测定采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清白蛋白为标准溶液，考马斯亮蓝G250为显色剂，在分光光度计测定所生产的抗菌肽的浓度。本方法生产的抗菌肽的浓度是常规提取量的10倍。应用实例150只15日龄肉鸡(经过健康检査无菌)分为A、 B、 C、 D、 E共5组， 每组30只，B、 C、 D、 E组经过人工感染0. lml混合病毒鸡新城疫病毒强毒攻-毒后作实验。A组为健康组〃 不感染病毒，不给药;B组阴性对照组，感染病 毒，不给药；C组和D组为本专利技术的方法制备的产品，C组为低剂量组，按0. 02 g/鸡/天注射；D组为药物组合物高剂量组，按0.04 g/鸡/天注射；E组为传 统"黄芪多糖"治疗组，按0.1g/鸡/天给药。结果表明，采用本专利技术一种 抗病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法制备的产品对鸡法氏囊病有着明 显的治疗作用。 实验结果如下<table>table see original document page 6<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法，其特征是由如下步骤组成：　　　　（１）用禽流感病毒疫苗、新城疫病毒疫苗、鸡法氏囊病毒疫苗各１－５ｍＬ肌肉注射免疫４０－１２０日龄实验猪，首次免疫后第７－２０天，再以上述疫苗各２ｍＬ肌肉注射加强免疫；　　　　（２）密切监测实验猪体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到高峰值时，无菌采取实验猪脾脏或抗凝血，用脾脏或抗凝血制备淋巴细胞单层；　　　　（３）对淋巴细胞单层进行传代培养；　　　　（４）当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养，即获得抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田杏芳，王连民，
申请(专利权)人：天津生机集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]