大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途，属于生物技术领域。本发明专利技术将重组大肠杆菌工程菌经过发酵培养、向其中加入IPTG经过诱导4‑6小时后结束发酵，离心获得菌体，将所述菌体经过破碎裂解得到鸡干扰素α蛋白包涵体，将所述鸡干扰素α蛋白包涵体经过变性溶解，并利用镍‑琼脂糖凝胶FF层析柱进行层析纯化，之后经过蛋白复性，并与保护剂混合同时加入注射用水稀释，经过分装获得重组鸡干扰素α的成品，不仅实现了菌体的高密度发酵，同时显著提高了鸡干扰素α蛋白纯化的效果以及生物学活性。

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途
本专利技术属于生物
，具体涉及一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途。
技术介绍
干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的糖蛋白，通过抑制病毒DNA和RNA的复制达到预防和治疗效果。1957年自Isaacs和Lindenmann发现干扰素以来，干扰素已经显示出了极强的抗病毒、免疫调节活性和广阔的应用前景。因而，干扰素的研究越来越受到人们的广泛关注。与传统的保健治疗药物相比，干扰素在治疗效果及使用时机方面显示出了极大的优越性。由于干扰素具有强大的抗病毒作用，目前有许多研究报道用于治疗家禽病毒性疾病。大量研究结果表明，重组鸡干扰素α在用于防治鸡禽流感、传染性法氏囊炎、传染性支气管炎等病毒性疾病时，具有显著的抗病毒效果。基因工程干扰素是采用基因工程技术将动物体内天然干扰素基因亚克隆入原核表达载体，继而转入受体细胞，构建工程菌。通过工程菌发酵表达，分离纯化等步骤最终获得的高纯度干扰素产品。本专利技术公开了一种大肠杆菌工程菌表达的重组鸡干扰素α产品制备及其应用效果，属于用分子生物学方法获得的基因工程生物制品。将新型设计的鸡α干扰素基因序列重组到pET21a(+)载体，然后通过转化方式转入受体大肠杆菌。并采用大肠杆菌表达系统表达外源基因，有利于鸡α干扰素基因商业化生产。所制备的产品可用于制备病害防治药物、免疫增强剂，也可用于禽类免疫机制的理论研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题在于提供一种大肠杆菌工程菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途。所述大肠杆菌工程菌是以BL21(DE3)作为宿主，构建的工程菌株为：E.coliBL21(DE3)/pET21a(+)-ChIFNα。所述工程菌株及其构建方法来源于申请号为201410755900.7的专利技术专利《重组鸡干扰素α及其制备方法》。所述工程菌株表达的重组鸡干扰素α的cDNA序列为优化后的基因序列如SEQIDNO：1所示。为了解决上述问题，本专利技术提供一种大肠杆菌工程菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，步骤如下：将大肠杆菌工程菌经过发酵培养、向其中加入IPTG经过诱导4-6小时后结束发酵，离心获得菌体，将所述菌体经过破碎裂解得到重组鸡干扰素α蛋白包涵体，将所述重组鸡干扰素α蛋白包涵体经过变性溶解，并利用镍-琼脂糖凝胶FF层析柱进行层析纯化，之后经过蛋白复性，并与保护剂混合同时加入注射用水稀释，经过分装获得重组鸡干扰素α的成品；所述蛋白复性中所用复性液组成为：0.5M精氨酸，2mMEDTA，0.8mMGSSG(氧化型谷胱甘肽)，50mMTris，20％甘油，余量为水，pH7.0。(％为质量百分比)优选地，所述层析纯化中所用洗脱缓冲液组成为：6MGU-HCl，20mMtris-HCl，500mM咪唑，余量为水，pH7.5。优选地，所述工程菌发酵培养步骤为：将所述工程菌经活化后按照接种量5％-10％接种于发酵培养基中，36.8-37.2℃条件下发酵，控制pH值6.8-7.2，通过搅拌速度及通气量控制溶氧≥30％。优选地，所述大肠杆菌工程菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，步骤如下：(1)菌种的发酵：将所述工程菌经活化后按照接种量5％-10％接种于发酵培养基中，36.8-37.2℃条件下发酵，控制pH值6.8-7.2，通过搅拌速度及通气量控制溶氧≥30％；(2)诱导：待发酵培养至菌体浓度OD600nm＝40时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，至终浓度为0.5-l.0mmol/L，诱导干扰素的表达，诱导4-6小时后结束发酵，经离心收集湿菌体；(3)菌体破碎裂解：向所述步骤(2)得到的湿菌体中按照质量体积比1：(9-11)加入裂解缓冲液，经混合、超声、离心后，收集沉淀，得到重组鸡干扰素α蛋白包涵体；(4)包涵体变性溶解：将所述包涵体用10-20倍体积的变性溶解液，经混合溶解后经离心，收集变性液，弃沉淀，得到粗制重组鸡干扰素α变性液；所述变性溶解液组成为：6M的盐酸胍，1.5mMEDTA，30mMTris，8mMDTT，余量为水；(5)包涵体层析纯化：利用结合缓冲液将镍-琼脂糖凝胶FF层析柱平衡后，将所述粗制重组鸡干扰素α变性液进行上样，流速为50-100cm/h，上样完毕后分别经所述结合缓冲液去除杂蛋白、洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，得到纯化后的重组鸡干扰素α变性液；所述结合缓冲液组成为：6MGU-HCl，20mMtris-HCl，0.5MNaCl，20mm咪唑，余量为水，pH7.5；(6)包涵体蛋白的复性：将所述纯化后的重组鸡干扰素α变性液按照与复性液体积比1:(14-16)，滴入复性液中，连续搅拌复性至少48h，即为重组鸡干扰素α复性原液；所述重组鸡干扰素α原液的生物学活性，即比活性(生物学活性与蛋白质之比)高达1.05×109IU/mg左右；(7)所述重组鸡干扰素α复性原液经与保护剂混合同时加入注射用水稀释后经分装获得重组鸡干扰素α的成品。本专利技术所提供了菌体破碎、包涵体变性、纯化及复性的生产工艺，工艺适合工业化生产，产品纯度＞95.0％。优选地，所述步骤(1)中，待培养2.5-3.5h后，溶氧反弹开始补充料液，补料速度800mL-1600mL/h，补料体积5L；所述料液的组成为(g/L)：葡萄糖：200，蛋白胨：10，酵母粉：10，余量为水。优选地，所述步骤(1)中，菌种活化步骤为：将所述工程菌，在LB培养皿上划线，37℃恒温培养过夜，待长出单菌落后，作为一级种子；将所述一级种子划线接种LB固体培养基平板，36.8-37.2℃培养18-24小时后，将单菌落转移至LB液体培养基，36.8-37.2℃，200r/min震荡培养至菌体浓度OD600nm＝3.0时，然后按照菌液与培养基体积比1：10接种LB液体培养基，36.8-37.2℃，200r/min震荡培养至发酵液菌体浓度达到0D600值3.0，得到种子液。优选地，所述步骤(2)中，离心条件为：4℃条件下以12000-14000r/min离心15min-20min，收集湿菌体，向所述湿菌体中加入PBS溶液，按照质量体积比1:10混合，12000-14000r/min离心15min-20min，收集湿菌体；所述PBS溶液组成为NaCl8.0g/L、KCl0.2g/L、Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L，余量为水。优选地，所述步骤(3)中，超声条件为：以2400w功率进行间歇超声破碎细菌，超声5s，停20s，超声总时间：35min。优选地，所述步骤(3)中，所述裂解缓冲液组成为：Tris0.05M，EDTA5mM，NaCl0.1369M，余量为水，pH8.5。优选地，所述步骤(3)中，离心条件为12000-14000r/min离心20min。优选地，所述步骤(4)中，离心条件为12000-14000r/min，离心15-20分钟。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：步骤如下：/n将大肠杆菌工程菌经过发酵培养、向其中加入IPTG经过诱导4-6小时后结束发酵，离心获得菌体，将所述菌体经过破碎裂解得到重组鸡干扰素α蛋白包涵体，将所述重组鸡干扰素α蛋白包涵体经过变性溶解，并利用镍-琼脂糖凝胶FF层析柱进行层析纯化，之后经过蛋白复性，并与保护剂混合同时加入注射用水稀释，经分装获得重组鸡干扰素α产品；/n所述蛋白复性中所用复性液组成为：精氨酸0.5M，2mM EDTA，0.8mM GSSG，50mM Tris，20％甘油，余量为水，pH7.0。/n

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：步骤如下：
将大肠杆菌工程菌经过发酵培养、向其中加入IPTG经过诱导4-6小时后结束发酵，离心获得菌体，将所述菌体经过破碎裂解得到重组鸡干扰素α蛋白包涵体，将所述重组鸡干扰素α蛋白包涵体经过变性溶解，并利用镍-琼脂糖凝胶FF层析柱进行层析纯化，之后经过蛋白复性，并与保护剂混合同时加入注射用水稀释，经分装获得重组鸡干扰素α产品；
所述蛋白复性中所用复性液组成为：精氨酸0.5M，2mMEDTA，0.8mMGSSG，50mMTris，20％甘油，余量为水，pH7.0。


2.如权利要求1所述的一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：所述层析纯化中所用洗脱缓冲液组成为：6MGU-HCl，20mMtris-HCl，500mm咪唑，余量为水，pH7.5。


3.如权利要求1所述的一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌工程菌发酵培养步骤为：将所述大肠杆菌工程菌经活化后按照接种量5％-10％接种于发酵培养基中，36.8-37.2℃条件下发酵，控制pH值6.8-7.2，通过搅拌速度及通气量控制溶氧≥30％。


4.如权利要求2所述的一种大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)将所述工程菌经活化后按照接种量5％-10％接种于发酵培养基中，于36.8-37.2℃，pH6.8-7.2下发酵，控制溶氧≥30％；
(2)待发酵培养至菌体浓度OD600nm＝40时，加入IPTG至终浓度为0.5-lmmol/L，诱导4-6小时后结束发酵，经离心收集湿菌体；
(3)向所述步骤(2)得到的湿菌体中按照质量体积比1：(9-11)加入裂解缓冲液，经混合、超声、离心后，收集沉淀，得到重组鸡干扰素α蛋白包涵体；
(4)将所述重组鸡干扰素α蛋白包涵体用10-20倍体积的变性溶解液，经混合溶解后经离心，收集变性液，弃沉淀，得到粗制重组鸡干扰素α变性液；所述变性溶解液组成为：6M的盐酸胍，1.5mMEDTA，30mMTris，8mMDTT，余量为水...

【专利技术属性】
技术研发人员：王连民，高应瑞，刘珂飞，
申请(专利权)人：天津生机集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12