因子Ⅷ的分离制造技术

本发明专利技术公开了利用含有分离膜的基于膜的分离系统以在至少两个限制膜之间建立第一个和第二个隙间体积来分离功能活性因子Ⅷ的方法。将一种或者多种稳定剂加入到样品和／或隙间体积中。第一个隙间体积中的溶剂保持ＦⅧ在需要的电荷状态。在第一个和第二个隙间体积之间施加电压使得在分离膜的一侧的ＦⅧ与在分离膜另一侧的不需要的分子分隔开。这些方法也可用作传统分离天然或者重组ＦⅧ纯化方案中一个或多个步骤的替代。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及用于从血液或者重组来源分离凝血因子的方法和装置，尤其是从血浆中分离因子VIII的方法和装置。
技术介绍
人因子VIII(FVIII)是一种结合了von Willebrand因子(vWF)在血浆(0.1μg/mL)中循环的265kDa糖蛋白。糖蛋白对引起其激活和破坏的蛋白酶解加工高度敏感，从而调节其在凝固级联(血液凝固)中作为辅因子的作用。激活的FVIII(FVllla)是激活凝血因子X到因子Xa的辅因子。FVIII的缺乏可能导致出血紊乱的血友病A。来自血浆的FVIII平均工业产量为每升血浆140到270国际单位(IU)(1IU是在1mL混合血浆中发现的FVIII活性的平均量＝0.2μg)。FVIII传统纯化的第一步通常是冷冻沉淀(传统科恩级分分离法)产率40-50％的FVIII。含有FVIII的冷沉淀物利用色谱法，通常是免疫亲和以及离子交换进行处理。在每个加工步骤将FVIII减至损失最少目的是提高产量，因为目前合适FVIII的供应是不足的。HemasureDenmark A/S已经发展了以求克服目前血浆传统科恩级分分离法存在问题的技术。Hemasure使用大容量凝胶过滤步骤代替从前的冷冻沉淀步骤，据报道提供了产率为60-70％的FVIII，整个过程产生200 IUFVIII/升血浆，J. Dam，Downstream，vol.31，P. 65(Dec.1999)。虽然这个方法产量提高，但是在加工中仍然有FVIII的大量损失。重组产品是FVIII的另一来源，但是这个来源尚未代替从天然来源获得的FVIII。目前的纯化方案耗时，引起FVIII的大量损失，并且不能在对FVIII活性或者产量无不利影响的情况下充分去除病原体，尤其是病毒。据报道有数千个不同蛋白共存在血浆中。从这些复杂混合物中获得特定蛋白可能很难，特别是如果特定蛋白在其分离状态必须保持其生物活性的情况下。目前，很难从血浆中以合理量提纯或者分离高产率的FVIII。例如，对于具有平均蛋白浓度70mg/mL的血浆而言，FVIII(～0.1μg/mL)仅仅大约占总血浆蛋白的0.00014％。在血浆或者重组来源存在这样低浓度的FVIII通常需要大量血浆或者其它来源以获得合理的市售产量。因此，生产费用增加并且通常需要工序的减少。FVIII是一种在血浆中相对不稳定的蛋白。因此，应用于FVIII分离的标准纯化技术难以得到用于获取大量有生物活性FVIII的方法。当前的方法包括在纯化方案的最后用稳定剂，最常用的是人白蛋白稳定FVIII制备物。但是，在纯化过程的最后添加可能已来不及保护分离的FVIII活性。用蔗糖制成的“Kogenate-F”，一种重组FVIII(rFVIII)治疗产品可以免除向制备物添加人白蛋白的需要。FVIII制备物的病毒污染也是一个潜在问题。通常，溶剂表面活性剂(SD)，巴氏灭菌法，亚甲基蓝(MB)和UV处理或者它们的组合用来使FVIII制备物中的病毒失活。但是，传统病毒去除步骤通常引起FVIII的损失或者失活。专利技术概述本申请涉及利用基于膜的电泳分离系统分离功能活性因子VIII的多种方法和装置。一方面，这些方法利用含有分离膜的电泳装置建立在至少两种限制膜之间的第一个和第二个隙间体积。一种或者多种稳定剂被添加到样品和/或一个隙间体积中。第一个隙间体积的溶剂维持FVIII在需要的电荷状态。在第一个和第二次隙间体积之间施加电压使在分离膜一侧的FVIII与分离膜另一侧的不需要的分子分割开来。第一方面，本专利技术提供了一种从样品获得因子VIII(FVIII)的方法，所述方法包括(a)将含有FVIII的样品放置在包括分离膜，第一个限制膜和第二个限制膜的电泳装置的隙间体积中，所述分离膜具有确定的孔径，其截留分子量不同于所述FVIII的分子量，第一个限制膜位于第一个电极区域和分离膜之间以便形成它们之间的第一个隙间体积，第二个限制膜位于第二个电极区域和分离膜之间以便形成它们之间的第二个隙间体积；(b)向一种或者多种样品，第一个隙间体积，或者第二个隙间体积提供一种或者多种稳定剂；(c)选择一种具有限定pH的溶剂使得FVIII具有需要的电荷状态；(d)在第一个和第二个隙间体积之间施加电压，其中含有FVIII的终产物位于分离膜的一侧，而不需要的分子基本上位于分离膜的另一侧；以及(e)继续步骤(d)直到需要量的FVIII位于分离膜的一侧。第二方面，本专利技术提供了从样品中获得因子VIII(FVIII)的方法，所述方法包括(a)将含有FVIII的样品放置在包括分离膜，第一个限制膜和第二个限制膜的电泳装置的第一个隙间体积中，所述分离膜具有确定的孔径，其截留分子量大于FVIII分子量，第一个限制膜位于第一个电极区域和分离膜之间以便形成它们之间的第一个隙间体积，第二个限制膜位于第二个电极区域和分离膜之间以便形成它们之间的第二个隙间体积；(b)向样品和第二隙间体积中的任一个或两个提供一种或者多种稳定剂；(c)选择用于第一个隙间体积、具有限定pH的溶剂使得FVIII具有需要的电荷状态；(d)在第一个和第二个隙间体积之间施加电压使得在第一个隙间体积中的FVIII迁移通过分离膜进入第二个隙间体积形成含有FVIII的终产物，而不需要的分子基本上被阻止进入第二个隙间体积；以及(e)继续步骤(d)直到需要量的FVIII迁移进入第二个隙间体积。第三方面，本专利技术提供了用于从样品中获得因子VIII(FVIII)的方法，所述方法包括(a)将含有FVIII的样品放置在包括分离膜，第一个限制膜和第二个限制膜的电泳装置的第一个隙间体积中，所述分离膜具有确定的孔径，其截留分子量小于FVIII分子量，第一个限制膜位于第一个电极区域和分离膜之间以便形成它们之间的第一个隙间体积，第二个限制膜位于第二个电极区域和分离膜之间以便形成它们之间的第二个隙间体积；(b)向样品和第二隙间体积中的任一个或两个提供一种或者多种稳定剂；(c)选择用于第一个隙间体积、具有一pH的溶剂使得FVIII具有需要的电荷状态；(d)在第一个和第二个隙间体积之间施加电压使得在第一个隙间体积中除FVIII以外的样品组分迁移通过分离膜进入第二个隙间体积，而FVIII基本上被阻止进入第二个隙间体积并且保持在第一个隙间体积中作为终产物；以及(e)继续步骤(d)直到样品中需要量的组分从第一个隙间体积去除，而FVIII保持在第一个隙间体积中。优选地，样品为血浆或者其部分，冷沉淀物或者其部分，重组FVIII来源，或者其组合或者混合物。优选地，稳定剂为一种或者多种缓冲成分，改变摩尔浓度的组分，蛋白，氨基酸，或者糖。稳定剂可能是一种或者多种山梨糖醇，盐，甘油，诸如蔗糖、乳糖和葡聚糖/葡萄糖的糖，甘氨酸，凝胶，乙酸钾，叠氮化物，或者蛋白酶抑制剂。稳定剂优选为白蛋白，氨基酸的混合物、蔗糖，或者它们的混合物。优选地，白蛋白的应用浓度为至少大约2mg/mL(2g/L)，氨基酸混合物的应用浓度为至少大约0.01g/mL(10g/L)，蔗糖的应用浓度为至少大约1％(10g/L)。更优选地，白蛋白的应用浓度为至少大约10mg/mL(10g/L)，氨基酸混合物的应用浓度为大约0.05g/mL(50g/L)，蔗糖的应用浓度为大约5％(50g/L)。在一种优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从样品获得因子Ⅷ（ＦⅧ）的方法，所述方法包括：（ａ）将含有ＦⅧ的样品放置在包括分离膜，第一个限制膜和第二个限制膜的电泳装置的隙间体积中，所述分离膜具有确定的孔径，其截留分子量不同于所述ＦⅧ分子量，第一个限制膜位于第一个电极区域和 分离膜之间以便形成它们之间的第一个隙间体积，第二个限制膜位于第二个电极区域和分离膜之间以便形成它们之间的第二个隙间体积；（ｂ）向一种或者多种样品，第一个隙间体积，或者第二个隙间体积提供一种或者多种稳定剂；（ｃ）选择一种具有限 定ｐＨ的溶剂使得ＦⅧ具有需要的电荷状态；（ｄ）在第一个和第二个隙间体积之间施加电压，其中含有ＦⅧ的终产物位于分离膜的一侧，而不需要的分子基本上位于分离膜的另一侧；以及（ｅ）继续步骤（ｄ）直到需要量的ＦⅧ位于分离膜的一侧。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：伊丽莎白西布鲁克，托马斯诺曼特顿，布伦顿康兰，
申请(专利权)人：格拉迪普有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]