本发明专利技术涉及对人因子Ⅷ（ＦⅧ）进行修饰，从而导致当用于体内时与任何未修饰的亲代抗体相比基本无免疫原性或具低的免疫原性的ＦＶ Ⅷ蛋白质。本发明专利技术也涉及来源于所述未经修饰的蛋白质的Ｔ－细胞表位肽，通过该肽可以构建具有降低的免疫原性的修饰的ＦⅧ变体。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及尤其是向人施用的且特别是用于治疗用途的多肽。该多肽是修饰的多肽，所述修饰导致该多肽当给予人被试者时具有减少的引起免疫反应的倾向。本专利技术具体地涉及对人因子VIII(FVIII)进行修饰，从而导致当体内应用时与任何未修饰的对应物相比基本无免疫原性或具低的免疫原性的因子VIII蛋白质。本专利技术还涉及来源于所述未修饰的蛋白质的T细胞表位肽，通过这些肽可以构建具有降低的免疫原性的FVIII修饰变体。
技术介绍
有许多关于治疗性蛋白质的功效受对该治疗性蛋白质有害的免疫反应限制的例子。几种小鼠单克隆抗体已显示出有希望用作许多人类疾病情形的治疗剂，但在某些情况下由于引起显著程度的人抗-鼠抗体(HAMA)反应而失败。对于单克隆抗体已发展了许多技术来试图减少HAMA反应。这些重组DNA方法通常减少最终抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。但是，在几种情况下，结果所得的“人源化”抗体仍然在患者中引起免疫反应。抗体不是唯一一类作为治疗剂给药而可产生免疫反应的多肽分子。即使人来源的且与人体内存在的蛋白质具有相同氨基酸序列的蛋白质也可诱导人体内免疫反应。显著的例子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和干扰素α2等的治疗应用。在这些人蛋白质具有免疫原性的情况下，原本在这些个体中起作用的针对这些蛋白质的免疫耐受性，推测将被破坏。这种将人蛋白质用作替代疗法的情形是不同的，例如用在所说蛋白质天然不足的遗传性疾病的治疗中，诸如血友病、Christmas病、Gauchers病之类疾病以及许多其它例子中。在这样的情况中，治疗用的替代蛋白质从开始就可起到免疫学上外源分子的作用，并且当个体能对治疗剂产生免疫应答时，治疗的效力有可能被显著降低。无论所说的蛋白质治疗剂是否被宿主免疫系统认作外源分子，或现存的对这些分子的耐受性是否被克服，对这些蛋白质的免疫反应性的机制是相同的。诱发免疫应答的关键是在这些蛋白质内存在能通过呈递于II型MHC分子上而刺激T细胞活性的肽，即，所谓的“T细胞表位”。这样的T细胞表位通常被定义为能结合II型MHC分子的任何氨基酸序列。言外之意，“T细胞表位”指当结合MHC分子时能被T细胞受体(TCR)识别并至少在原则上能通过结合TCR促进T细胞应答而引起这些T细胞活化的表位。II型MHC分子是一组在辅助T-细胞的选择和活化中起重要作用的高度多态的蛋白质。人类DR类白细胞抗原(HLA-DR)是该组蛋白质的主要同种型，然而同种型HLA-DQ和HLA-DP也发挥相似的功能。在人类群体中，每个个体携带2-4个DR等位基因、2个DQ和2个DP等位基因。对于DR同种型来说约存在70种不同的同种异型，对于DQ是30种不同的同种异型，对于DP是47种不同的同种异型。许多DR分子的结构已得到了解析，这些结构显示为具有许多疏水口袋的开放式(open-ended)肽结合沟，这些疏水口袋与肽的疏水残基(口袋残基)啮合。MHC DR分子由在C末端插入细胞膜的α链和β链组成。每个异二聚体都具有能结合9-20个氨基酸长度的肽的配体结合域，但是结合沟最大能容纳11个氨基酸。最近的研究显示DQ分子具有同源结构，而且预期DP家族蛋白质将非常相似。确立不同II型MHC分子同种异型的多态性造成了肽结合沟中多种多样的不同肽结合表面，且在群体水平上确保了能够最大的灵活度地识别外源蛋白质及对病原体生物产生免疫反应。对治疗性蛋白质的免疫反应通过II型MHC肽呈递途径进行。在此，外源蛋白质被吞入并经加工以与DR、DQ或DP类的II型MHC分子结合进行呈递。II型MHC分子是由专门的抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞和树突细胞等表达的。II型MHC肽复合物与T-细胞表面上关连T-细胞受体的结合，加上某些其他共同受体如CD4分子的交互结合可诱导T-细胞内的活化状态。该活化导致细胞因子的释放，从而进一步活化其他淋巴细胞如B细胞以产生抗体，或者活化T杀伤细胞而形成完全的细胞免疫反应。T-细胞表位的鉴定是表位消除的第一步，然而在本领域中几乎没有清楚的案例将鉴定表位和去除表位整合在单个方案中。WO98/52976和WO00/34317讲授了鉴定多肽序列的计算穿线(computational threadingapproach)方法，该多肽序列具有与人II型MHC DR同种异型亚型结合的潜力。在这些讲授中，预测的T-细胞表位通过在目的蛋白质中应用合理的氨基酸替代而去除。然而利用该方案和其他鉴定表位的基于计算的程序，预测能够与II型MHC分子结合的肽可能并不会在所有情况下，特别是在体内(由于加工途径或其他现象)发挥T-细胞表位的功能。此外，这些预测T-细胞表位的计算方法通常不能够预测具有DP或DQ限制性的表位，尽管这些系统的表位识别通常相互重叠。除计算技术之外，存在测量合成的肽与II型MHC分子结合能力的体外方法。一种示例性的方法应用具有限定的MHC同种异型的B-细胞系作为II型MHC结合表面的来源，且可应用于II型MHC配体的鉴定中。然而，这种技术不适用于筛选可针对广泛多样的MHC同种异型的多重潜在表位，且它们也不能证实结合的肽能否发挥T-细胞表位的功能。最近采用重组MHC分子与合成的肽的可溶性复合物的技术已得到应用。这些试剂和方法可用于鉴定来自人或实验动物被试者的外周血液样品中是否存在能够结合特定的MHC-肽复合物的T-细胞克隆，但这些方法和试剂也不适用于筛选可针对广泛多样的MHC同种异型的多重潜在表位。T-细胞活化的生物学测定法可提供实际的选择方案，通过该方案可读出所检测的肽或整个蛋白质序列引起免疫反应的能力。该类方法的例子包括Petra等人的工作，该工作对细菌蛋白质葡萄球菌激酶应用T-细胞增殖测定，随后用合成的肽刺激T-细胞系以对表位进行作图。类似地，应用合成的破伤风毒素蛋白质的肽进行的T-细胞增殖测定导致对毒素中免疫优势表位的确定。WO99/53038公开了所测试蛋白质的T-细胞表位可用分离的人免疫细胞亚群进行确定的方法，其中细胞分离后，促进其在体外分化并在合成的目的肽存在时进行细胞培养，在培养的T-细胞中对任何诱导的增殖进行测量。相同技术也由Stickler等人描述，其中在两种情况下该方法应用于在细菌枯草杆菌蛋白酶中探测T-细胞表位。这种技术需要仔细地应用细胞分离技术和利用多种细胞因子补充物进行细胞培养以便获得想要的免疫细胞亚群(树突细胞、CD4+和/或CD8+T-细胞)，且不利于应用多个供体样品的快速通量筛选。如上所述，由此期望从给定的原则上有治疗价值但最初为免疫原性的肽、多肽或蛋白质中鉴定并去除或至少减少T-细胞表位。这种治疗上有价值的分子之一是FVIII。本专利技术提供除去了一个或多个T细胞表位的修饰形式的人FVIII。FVIII是固有的血液凝固途径中的一个凝血因子。FVIII是因子IXa的辅因子，其在钙离子和磷脂存在的条件下将因子X转变成活化形式Xa。现已对FVIII的分子遗传学有了很好的研究，相当重要的原因是当X-连锁基因中缺乏FVIII时会导致A型血友病。FVIII基因编码两种可选择剪切的转录产物，可产生A同种型的大糖蛋白FVIII和较小的B同种型。在天然状态下可鉴别到来源于A同种型前体的多种降解或加工形式，且特定的功能活性已被本文档来自技高网...
【技术保护点】
与未修饰的人因子Ⅷ相比包含特异改变的氨基酸残基、在体内使用时基本上无免疫原性或免疫原性较未修饰亲本分子低且具有基本上相同的生物学特异性和活性的经修饰人因子Ⅷ分子，其中所述已改变的氨基酸残基引起一个或多个在亲本未修饰分子中担当Ⅱ型ＭＨＣ结合配体并刺激Ｔ细胞的Ｔ细胞表位的减少或消除。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：T琼斯，M贝克尔，FJ卡尔，
申请(专利权)人：默克专利有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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