可溶性CLCA-1及CLCA-1的拮抗剂制造技术

本发明专利技术涉及通过施用可溶性ＣＬＣＡ１的抑制剂治疗疾病或状况的方法，其中疾病或状况中可溶性ＣＬＣＡ１的表达或活性上调。本发明专利技术也涉及从体液分离可溶性ＣＬＣＡ１的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及可溶性钙激活的氯离子通道1(CLCA1)以及抑制可溶性CLCA1活性的拮抗剂。本专利技术部分涉及分离和使用可溶性CLCA1及可溶性CLCA1的拮抗剂治疗与CLCA1的异常活性相关的疾病和状况的方法。
技术介绍
跨质膜离子转运对于保持细胞的正常生理学是关键的。多种充当通道和泵的膜结合蛋白质介导跨质膜离子转运。功能异常的离子通道或泵将导致疾病状态。囊性纤维化是cAMP介导的氯离子通道CFTR缺陷导致的疾病(Welsh等人，1993，Cell 731251)。囊性纤维化的生理表现包括由粘液向肺呼吸道和胃肠道的粘稠分泌物导致的呼吸道阻塞和随后病原微生物在肺呼吸道的建群(Clarke等人，1992，Science 2571125；Clarke等人，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91479；Eng等人，1996，Ped Pulmonol 2177)，以及胃肠道胰管的粘液填塞(WO 01/54685)。囊性纤维化与异常离子转运的关联使调查者假定功能异常的离子转运可能涉及其它具有相似症状的疾病。因此，诸如哮喘和慢性阻塞性通路疾病(COPD)，即肺气肿和慢性支气管炎这类疾病中牵涉功能异常的离子转运。CLCA1及其鼠同源物gob-5是假定的钙激活的氯离子通道(WO99/44620)。二者都牵涉到与哮喘有关的病理学。哮喘以对环境变态反应原的超敏反应为特征，所述超敏反应与炎症反应和粘蛋白产生增加有关(WO 01/54685；WO 99/44620)。在对变态反应原攻击的应答中，CLCA1和gob-5的表达上调。表达也与超量产生粘蛋白相关(Hoshino等人，2002，Am J Respir Crit Care Med 1651132)。粘膜上皮(muco-epidermal)细胞系中已经显示CLCA1和gob-5超表达诱导粘蛋白基因MUC5AC表达。另外，在小鼠体内模型中，腺病毒介导的反义疗法(antisense therapy)消除了gob-5高反应性和粘蛋白生产的作用(Nakanishi等人，2001，Proc Natl Acad Sci USA 985175)。有人提出CLCA1作为125kD前体表达，该前体经切割形成在细胞表面结合形成活性离子通道的90kD亚基和37kD亚基。也有人提出90kD亚基形成四个跨膜结构域。另外提出CLCA1的表达与跨质膜氯离子流相关，且非选择性氯离子通道抑制剂例如尼氟灭酸、4，4′-二异硫氰基茋-2，2′-二磺酸(4，4′-diisothiocyanatostilbene-2，2′-disulfonic acid)和二硫苏糖醇将取消该作用(Gruber等人，1999，Genomics 54200)。专利技术概述本专利技术至少部分基于CLCA1是能够与细胞外分子(例如细胞膜或细胞膜结合分子)相互作用(例如结合)的分泌蛋白质的发现。由于CLCA1是分泌蛋白质，所以它为治疗与CLCA1表达或活性升高有关的疾病提供了方便的靶，所述疾病例如特应性疾病，例如哮喘或以高水平粘蛋白为特征的COPD样疾病。本专利技术涉及治疗患有疾病或状况的受试者的方法，其中受试者体内CLCA1的表达或活性与没有疾病或状况的个体相比升高，所述方法包括以治疗有效量给该受试者施用至少一种抑制或防止可溶性CLCA1与细胞外分子相互作用或结合(例如与细胞膜分子结合)的试剂，从而治疗该疾病或状况。因此，本专利技术为治疗特应性疾病或状况如哮喘或诸如COPD这类疾病提供了新方法。本专利技术涉及调节细胞内CLCA1表达或活性(例如降低CLCA1表达或活性)的方法，所述方法包括以有效量施用至少一种抑制或防止可溶性CLCA1与细胞外分子相互作用或结合(例如与细胞膜分子结合)的试剂，从而降低CLCA1的表达或活性。所述试剂可以是抗体或其与CLCA1结合的抗原结合片段；小分子；肽或模拟肽(peptide mimetic)。本专利技术另外涉及分离CLCA1的方法，包括从受试者获得流体；将所述流体与CLCA1特异性结合配偶体接触，从而形成CLCA1和特异性结合配偶体之间的复合物；分离CLCA1与CLCA1特异性结合配偶体的复合物；以及破坏CLCA1与CLCA1特异性结合配偶体复合物，从而分离CLCA1。本专利技术的其它目的和优点将部分阐明于随后的说明书中，且部分从说明书中显而易见或可以通过实施本专利技术而学到。通过所附的权利要求书中具体指出的要素和组合将认识并获得本专利技术的目的和优点。应当理解，如所要求保护的，前面的一般性说明和下面的详述都仅为示范性和说明性的，而非本专利技术的限制。附图简述附图说明图1描述了人CLCA1的一级氨基酸序列。对VWA结构域加下划线，且以星号标记假定的N-连接的糖基化位点。以SS表示信号序列(SEQ ID NO10)。图2证明CLCA1和gob-5蛋白质均由经转染表达该蛋白质的COS细胞分泌。图3是证明经转染表达CLCA1的细胞的条件培养基、细胞裂解物和膜制剂中存在CLCA1的蛋白质印迹。图4描述使用计算机程序TMHMM对CLCA1与其他已知的膜结合和分泌蛋白质比较的疏水性分析。CLCA1不含任何跨膜α螺旋。图5描述使用计算机程序Split 4.0对CLCA1与其他已知的膜结合和分泌蛋白质比较的疏水性分析。CLCA1不含任何跨膜α螺旋。图6是证明CLCA1以多聚体分泌的蛋白质印迹。图7证明CLCA1是高度糖基化的。PNGase处理降低了该分泌蛋白质的大小。图8是证明CLCA1亚基不是由二硫键连接的蛋白质印迹。图9证明CLCA1存在于哮喘和非哮喘患者的BAL流体中。图10证明CLCA1以剂量依赖的方式激活MUC5AC启动子。图11描述了CLCA1缺失突变体示意图，该示意图显示了VWA结构域位置、MIDAS结构域残基和提议的切割位点。图12a显示由A549细胞中超表达CLCA1或gob-5诱导MUC5AC-萤光素酶报告基因。与载体转染的对照相比，CLCA和gob-5显示MUC5AC-萤光素酶报告基因活性诱导两倍。图12b显示HEK293细胞中的相似结果。图13显示在HEK 293和A549细胞中瞬时表达的CLCA1和gob-5的全细胞膜片钳记录。图13(a)显示在移液管溶液(pipettesolution)中含有0.5M游离Ca2+时，HEK 293细胞(左栏)和A549细胞(右栏)中瞬时表达的CLCA1的电流-电压关系(每组n＝6-8)。图13(b)显示瞬时表达hCLCA1(左栏)和gob-5(右栏)的HEK 293细胞中全细胞电流密度的钙依赖的倍数增长(每组n＝3-8)。在A549中观察到相似的数据(数据未显示)。图14是显示在HEK293细胞和A549细胞中表达CLCA1和gob-5的蛋白质印迹。实施方案描述此处所用的抗体指免疫球蛋白或其部分，并包括含有抗原结合部位的任何多肽，而无论该多肽的来源、生产方法或其它特征。该术语包括例如多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂交、突变和CDR移植抗体。抗体的部分可以包括可以结合抗原的任何片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv。此处所用的术语“CLCA1”指不是跨膜蛋白质的蛋白质。它可以与膜或膜结合分子或分泌分子共价或非共价结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
治疗患有疾病或状况的受试者的方法，其中ＣＬＣＡ１在受试者体内的表达或活性与没有疾病或状况的个体相比升高，所述方法包含对该受试者施用治疗有效量的至少一种抑制或防止可溶性ＣＬＣＡ１与细胞膜分子结合的试剂，从而治疗该疾病或状况。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：AJ龙，CR伍德，M鲍曼，SJ戈尔德曼，JP赛佩克，
申请(专利权)人：惠氏公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]