１Ｂ２０　ＰＣＳＫ９拮抗剂制造技术

本文公开了人类枯草溶菌素转化酶９（“ＰＣＳＫ９”）的拮抗剂。本文公开的拮抗剂能有效抑制ＰＣＳＫ９的功能，因此是目前用于治疗与ＰＣＳＫ９活性相关的病症的合意的拮抗剂。本发明专利技术还公开了编码所述拮抗剂的核酸、包含所述拮抗机的载体、宿主细胞及组合物。本文还公开了制备ＰＣＳＫ９特异性拮抗剂的方法及利用该拮抗剂抑制或拮抗ＰＣＳＫ９功能的方法，这些构成了本公开的其他方面。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】1B20 PCSK9拮抗剂相关申请的交叉引用本申请要求申请日为2008年2月7日的美国临时专利申请61/063，980的优先权。关于联邦政府资助研发的相关声明不适用。微缩胶片附录的引用不适用。
技术介绍
枯草溶菌素转化酶9(下文称为“PCSK9”)，亦称作神经细胞凋亡调节转化酶 1(NARC-I)是蛋白酶K样的枯草杆菌酶，经鉴定为分泌性枯草杆菌酶家族中的第9个成员 (见 Seidah 等人，2003 PNAS100 :928_933)。PCSK9 基因位于人类染色体 1ρ33_ρ34. 3 (Seidah 等人，同上)。PCSK9表达于具有增殖和分化能力的细胞中，包括，例如肝细胞、肾间质细胞、 回肠与结肠上皮细胞和胚胎端脑神经元等(Seidah等人，同上)。最初合成的PCSK9为非活性酶前体或酶原的形式，其分子量约为大约72kDa，该酶 原可于内质网(‘‘ER”)内进行自我催化性分子内加工过程以激活其功能。据报道，这种内 部加工事件发生于SSVFAQ丨SIPWNL158基序(序号分别为SEQ ID 19和20) (Benjannet 等人，2004 J. Biol. Chem. 279 :48865_48875。据报道，这种内部加工是蛋白脱离内质网所必 需的(Benjarmet等人，同上；Seidah等人，同上)。经过切割并因此被激活的蛋白与切割的 多肽一起分泌(同上)。人类PCSK9基因序列(长度约22kb，包括12个外显子，编码含692个氨基酸的 蛋白质)的一个例子见保藏号NP_777596.2PCSK9。已经收藏了人类、小鼠和大鼠的PCSK9 的核酸序列，分别参见例如GenBank条目号AX127530(亦即AX207686)、NP_705793 (亦即 Q80W65)和P5996。PCSK9含有若干在其他前蛋白转化酶中发现的结构域，包括N端信号序 列、前体结构域、催化结构域和富含半胱氨酸的C端结构域。PCSK9催化结构域与枯草杆菌 酶的蛋白酶K家族具有高度序列同一性，特别是都具有D186、H226和S386催化三元体。PCSK9在若干专利公开物中被公开和/或要求保护，包括但不限于下列PCT公开 号W0 01/31007,WO 01/5708UW0 02/14358,WO 01/98468,WO 02/102993,WO 02/102994、 WO 02/46383、W002/90526、WO 01/77137 和 WO 01/34768 ；美国公开号US2004/0009553 和 US 2003/0119038 ；以及欧洲公开号EP 1 440 981, EP 1 067 182 和 EP 1 471 152。已经发现PCSK9在肝细胞和神经细胞的分化中发挥作用(Seidah等人，同上)，在 胚胎肝脏中高度表达，并对胆固醇体内平衡具有非常重要的意义。研究结果表明，PCSK9在 胆固醇生物合成或摄取中具有特异性作用。在一项胆固醇饲喂大鼠的研究中，Maxwell等 人发现，PCSK9表达水平下调与参与胆固醇生物合成的其他三个基因相似(Maxwell等人， 2003 J. Lipid Res. 44 =2109-2119) 实际上，已有研究显示PCSK9基因受固醇调控元件结 合蛋白(‘‘SREBP”)调控，这与观察到的其他参与胆固醇代谢的基因相同(同上)。后来一 项关于PCSK9转录调控的研究支持这些发现，该研究证实，这种调控对于其他参与脂蛋白代谢基因是非常典型的(Dubuc等人，2004《动脉硬化和栓塞血管生物学》。24 =1454-1459) 0 已经表明抑制素(statin)使PCSK9的表达上调，这归结于药物的降低胆固醇水平的效应 (同上)。此外，研究还显示，PCSK启动子具有两个与胆固醇调节有关的保守位点，一个为 固醇调控元件，另一个为Spl位点(同上)。尤其是，数套研究证据均证明，PCSK9降低肝LDLR的数量，因此减弱了肝脏清 除循环中LDL胆固醇的能力。腺病毒介导的PCSK9在小鼠肝脏中的过度表达导致循环 的LDL-C因肝LDLR蛋白大量丧失而积累，对于LDLR mRNA水平无影响(Benjannet等人， 2004, J.Biol. Chem. 279 48865-48875 ；Maxwell & Breslow，2004 PNAS101 :7100_7105 ； Park 等人，2004 J. Biol. Chem. 279 :50630_50638 ；和 Lalanne 等人，2005 J. Lipid Res. 46 1312-1319)。PCSK9过度表达对小鼠中循环的LDL-C水平升高的影响完全依赖于LDLR的 表达，这再次表明，PCSK9对LDL-C的调节是通过下调LDLR蛋白而介导的。与这些发现相 一致，缺乏PCSK9的小鼠或PCSK9mRNA水平因反义寡聚核苷酸抑制剂而降低的小鼠具有更 高水平的肝脏LDLR蛋白和更强的清除循环的LDL-C的能力(Rashid等人，2005，PNAS 102 5374-5379 ；和 Graham 等人，2007 J. Lipid Res. 48 (4) :763_767)。此外，通过 siRNA 使培 养的人肝细胞中PCSK9水平下降也会引起LDLR蛋白水平升高，且使吸收LDL-C的能力增强 (Benjannet 等人，2004 J. Biol. Chem. 279 48865-48875 ；和 Lalanne 等人，2005 J. Lipid Res. 46 1312-1319)。总之，这些研究数据表明，PCSK9作用导致通过降低LDLR蛋白水平引 起LDL-C水平升高。另有研究证实，PCSK9基因的多个突变与常染色体显性高胆固醇血症(“ADH”)有 关，该病症是遗传性代谢紊乱，其特征为血浆中低密度脂蛋白(“LDL”)颗粒显著增加，这会 导致早期心血管功能衰竭(见 Abitadel 等人，2003，Nature Genetics 34 154-156 ；Timms 等人，2004，Hum. Genet. 114 :349_353 ；Leren, 2004, Clin. Genet. 65 :419_422)。Abifadel 等 人后来发表的一项关于S127R突变的研究(同上)显示，携带这种突变的患者表现出总胆 固醇含量升高，以及在血浆中含有apoBlOO，这是由于(1)含apoBlOO脂蛋白，如低密度脂蛋 白(“LDL”)、极低密度脂蛋白(“VLDL”)和中等密度脂蛋白(“IDL”)的过量产生，和(2) 所述脂蛋白的清除或转化作用相应减弱(Ouguerram等人，2004，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24 :1448_1453)。因此，毫无疑问，PCSK9在LDL调控中发挥作用。PCSK9的表达或上调表达与血 浆LDL胆固醇水平升高有关，且PCSK9相应的抑制或表达缺失与血浆LDL胆固醇水平下降 相关。已有研究发现，与PCSK9序列变异有关的LDL胆固醇水平赋予抵抗冠心病的保护 (Cohen, 2006，N. Engl. J. Med. 354 1264-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的ＰＣＳＫ９特异性拮抗剂，其包括：　　（ａ）包含ＣＤＲ３结构域的重链可变区，该ＣＤＲ３结构域包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７或其等同物，所述等同物的特征在于在ＣＤＲ３结构域中具有一个或更多个保守性氨基酸取代；且／或　　（ｂ）包含ＣＤＲ３结构域的轻链可变区，该ＣＤＲ３结构域包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７或其等同物，所述等同物的特征在于在ＣＤＲ３结构域中具有一个或更多个保守性氨基酸取代；　　其中所述ＰＣＳＫ９特异性拮抗剂拮抗ＰＣＳＫ９对细胞ＬＤＬ摄取的抑制。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2008-2-7 61/063,980一种分离的PCSK9特异性拮抗剂，其包括(a)包含CDR3结构域的重链可变区，该CDR3结构域包含SEQID NO17或其等同物，所述等同物的特征在于在CDR3结构域中具有一个或更多个保守性氨基酸取代；且/或(b)包含CDR3结构域的轻链可变区，该CDR3结构域包含SEQID NO7或其等同物，所述等同物的特征在于在CDR3结构域中具有一个或更多个保守性氨基酸取代；其中所述PCSK9特异性拮抗剂拮抗PCSK9对细胞LDL摄取的抑制。2.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中CDR3结构域位于CDR3区域中的人类 胚系区。3.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的平衡解离常数(Kd) 小于 1200nM。4.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的Kd小于500nM。5.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的Kd小于ΙΟΟηΜ。6.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其与人类PCSK9结合的Kd小于5nM。7.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取的拮抗作用 的 IC5tl 低于 500nM。8.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取的拮抗作用 的 IC5tl 低于 200nM。9.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取的拮抗作用 的 IC50 低于 IOOnMo10.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取至少产生 20%的拮抗作用。11.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其是抗体分子。12.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其进一步包括(a)包含SEQID NO 13的重链可变区⑶Rl序列；(b)包含SEQID NO 15的重链可变区⑶R2序列；(c)包含SEQID NO 3的轻链可变区⑶Rl序列；和/或(d)包含SEQID NO 5的轻链可变区⑶R2序列。13.权利要求12所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中⑶R1、⑶R2和/或⑶R3结构域处 于各自的CDR1、CDR2和/或CDR3区域中的人类胚系区。14.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括(a)包含⑶R3结构域的重链可变区，该⑶R3结构域包含SEQIDNO 17 ；(b)包含⑶R3结构域的轻链可变区，该⑶R3结构域包含SEQIDNO 7 ；(c)重链可变区CDRl序列，其包含SEQID NO 13 ；(d)轻链可变区⑶Rl序列，其包含SEQID NO 3 ；(e)重链可变区⑶R2序列，其包含SEQID NO 15 ；及(f)轻链可变区CDR2序列，其包含SEQID NO :5。15.权利要求14所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中⑶R1、⑶R2和/或⑶R3结构域位 于各自的CDR1、CDR2和/或CDR3区域中的人类胚系可变区。16.权利要求12所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括包含SEQIDNO=Il的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO 27的轻链可变区。17.权利要求12所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括重链，所述重链具有包含SEQID NO 24的恒定序列。18.权利要求16所述的PCSK9特异性拮抗剂，其包括重链，所述重链具有包含SEQID NO 24的恒定序列。19.PCSK9特异性拮抗剂，其包括(a)包含SEQID NO 1的轻链；和(b)包含SEQID NO 11的重链；其中所述PCSK9特异性拮抗剂是抗体分子，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取具有拮抗作用。20.权利要求19所述的PCSK9特异性拮抗剂，其中SEQID NO=Il之后跟随氨基酸序 列，所述氨基酸序列选自 SEQ ID NO :21、SEQID NO 22、SEQ ID NO 23 禾P SEQ ID NO :24。21.分离的PCSK9特异性拮抗剂，其包括(a)包含SEQID NO 26的轻链；以及(b)包含SEQID NO 25的重链；其中所述PCSK9特异性拮抗剂是抗体分子，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取具有拮抗作用。22.分离的PCSK9特异性拮抗剂，其包括(a)SEQ ID NO 39的重链可变区CDR3序列；(b)SEQ ID NO 98的重链可变区CDR3序列；(c)SEQID NO 39的重链可变区CDR3序列；SEQ ID NO 37的重链CDRl序列；禾口 SEQ ID NO 38的重链CDR2序列；(d)SEQID NO 98的重链可变区CDR3序列；SEQ ID NO 37的重链CDRl序列；禾口 SEQ ID NO 97的重链CDR2序列；(e)SEQ ID NO 42的轻链可变区CDR3序列；(f)SEQ ID NO 101的轻链可变区CDR3序列；(g)SEQID NO 42的轻链可变区CDR3序列；SEQ ID NO 40的轻链CDRl序列；和SEQ ID NO 41的轻链CDR2序列；(h)SEQID NO 101的轻链可变区CDR3序列；SEQ ID NO 99的轻链CDRl序列；禾口 SEQ ID NO 100的轻链CDR2序列；⑴(a)和(e)皆有； (j) (b)和(f)皆有； (k) (c)和(g)皆有； (1) (d)和(h)皆有；(m)分别包含SEQ ID NO 44和SEQ ID NO 43的重链和/或轻链可变区； (η)分别包含SEQ ID NO 109和SEQ ID NO 108的重链和/或轻链可变区；或者 (ο)包含SEQ ID NOs :45-96或102-107中任一项的重链可变区及任选的包含SEQ ID NO 27的轻链可变区；其中所述PCSK9特异性拮抗剂是抗体分子，其对PCSK9抑制细胞LDL摄取具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：JH康德拉，RM库邦，HA哈蒙德，T麦凯布，S潘迪特，LB彼得森，JC桑托罗，A西特拉尼，DD伍德，H马赫，H尤德，SM格里戈里，JT布吕，K王，P罗，DK瑙罗基，P钟，F董，Y李，
申请(专利权)人：默沙东公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]